触珠蛋白对早期糖尿病肾病患者肾功能损害的预测作用

郑晓敏 杨芳远 刘翠平 杨金奎*

(1．清华大学附属垂杨柳医院内分泌科，北京 100022；2.首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科，北京 100730；3.糖尿病防治研究北京市重点实验室，北京 100730；4.北京市糖尿病研究所，北京 100730)

糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病的重要合并症，是造成慢性肾脏病和终末期肾病的主要原因[1-3]。DKD的早期确诊是预防和早期干预的基础。肾活检对各种类型的慢性肾病最有鉴别诊断价值，但因其有创程度高，不推荐常规检测，目前推荐采用随机尿测定尿白蛋白/肌酐(urine albumin to creatinine ratio，UACR)早期筛查DKD[4]，但由于其水平受多种因素影响，且长期观察结果发现，微量白蛋白尿的患者在10年中仅有30%～45%转变为大量白蛋白尿，有30%转变为尿白蛋白阴性，该现象在2型糖尿病患者中更为显著[5]。因此，尿白蛋白对诊断2型糖尿病肾病的特异性不足，对预测病情的转归也存在局限性。近年来研究[6-9]显示的某些尿中生物标志物也可用于诊断DKD，包括其他肾小球生物标志物如转铁蛋白(transferrin，TRF)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin, CP)、Ⅳ型胶原蛋白(type Ⅳ collagen, Co-Ⅳ)、层粘连蛋白(laminin,LN)、糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAG)等;肾小管生物标志物如中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)、α1-微球蛋白(α1-microglobulin，α1-MG)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)、肾脏损伤分子-1 (kidney injury molecule-1，KIM-1)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D glucosaminidase，NAG)、血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)等；炎性反应因子如肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)、类黏蛋白(orosomucoid)等；氧化应激相关分子如心脏脂肪酸结合蛋白(heart-fatty acid binding protein,H-FABP)、高级糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)等;足细胞生物标志物(podocalyxin、nephrine等)和血管生物标志物如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等来评估早期DKD。但其可靠性、特异性、敏感性仍需更多研究证实，目前尚未作为诊断依据。DKD的早期诊断仍是最具挑战性的公共健康问题[4]。

近年随着组学技术的进展，尿蛋白组学研究在糖尿病肾病早期诊断方面进展较多。通过对不同糖尿病患者尿蛋白质组进行分析发现尿触珠蛋白(haptoglobin，Hp)在早期DKD中可预测肾功能的进展，尿触珠蛋白/肌酐比(haptoglobin to creatinine ratio，HCR)可以作为糖尿病患者肾功能受损的早期标志物[10-12]。本文就Hp对早期糖尿病肾病患者肾功能损害的预测作用及相关机制进行综述。

1 触珠蛋白的生物学特征

1.1 Hp的结构

Hp又称结合珠蛋白，基因位于人类染色体16q22。Hp分子是由两条β链和两条α链通过二硫键连接组成的四聚体[13]。其中β链是相同的，Hp的多态性主要是α链的遗传变异造成。α链有两种等位基因Hp1和Hp2，形成3种不同的基因型，分别是Hp1-1、Hp2-1及Hp2-2。α链有a1和a2两种，其中a1又有a1S和a1F两种亚型，二者仅相差1个氨基酸，第54位氨基酸a1F为赖氨酸，a1S为谷氨酸。α1链含83个氨基酸，相对分子质量约9 100。α2含有1.7kb的内部重复，含有142个氨基酸，相对分子质量约16 000。纯合Hp1等位基因的蛋白质产物Hp1-1是单价体,相对分子质量86 000。Hp2等位基因产物杂合(Hp2-1)或纯合(Hp2-2)则形成多个Hp分子的多聚体：Hp2-1为各种线性同源二聚体和多聚体，Hp2-2形成环状聚合物。

1.2 Hp的分布和表达

Hp是血清α2球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白，广泛存在于人类和许多哺乳动物的血液和其他体液中。在人血浆循环中的浓度为0.3～3 g/L。Hp最初是在肝脏中作为炎性反应的急性期反应蛋白被分离，合成的主要部位为肝脏，后来发现它也存在于包括中性粒细胞和单核细胞在内的免疫细胞中[14]。另外有研究[15-16]证实肾近曲小管上皮细胞在炎性反应因子刺激下可以合成和分泌Hp,白色脂肪组织及其他的一些组织(胃、肠、肾上腺、肌肉、脑、附睾、食道、胎盘、卵巢、输尿管等)也有Hp的mRNA表达。

1.3 Hp的功能

Hp最主要的功能是与血浆中的游离血红蛋白(hemoglobin，Hb)结合并被清除，从而阻止游离Hb进一步的氧化还原反应和相应的组织损伤[17-18]。临床上很多造成红细胞破坏的原因如溶血、创伤等，均可引起血中游离Hb明显升高，游离Hb是一种强效氧化蛋白，其中的亚铁血红素成分被氧化后会导致细胞损伤和组织损伤[19-20]。Hp分子的每个β链上的Hb结合位点可以与血浆中的游离Hb结合，形成高亲和力、不可逆Hp-Hb复合物，进而被清除受体CD163识别并在细胞内进行消除，防止游离Hb对组织的损伤。此外，游离Hb可穿过肾小球滤过膜，导致肾脏氧化性损伤，而血浆中Hp可迅速与游离Hb结合并被清除，从而阻止游离Hb从肾小球滤过，防止Hb可能导致的肾小管损伤[21-22]。另外，Hp长期以来被认为是炎性反应的标志物[23]，具有抗氧化作用，它在抗感染、修复损伤组织以及保持内环境稳定的过程中起着重要作用。其血清含量在感染、创伤、炎性反应、肿瘤、心肌梗死等病理状态时显著升高[24]。在炎性反应和血管损伤时，血清中Hp增加，血流的持续变化也会诱导动脉壁中的Hp表达，并且通过促进成纤维细胞迁移参与血管重建和修复[25]。Hp在移植后炎性反应中也起重要作用，启动了移植物排斥过程[26]。此外，Hp尚有抗氧化活性、抑制前列腺素合成、抑制细菌、参与细胞凋亡及免疫反应。在许多情况下，Hp上调是为了应对潜在的有害状态，这通常可以早期提示疾病或其他病理改变[16,27]。

2 Hp与DKD的临床研究

很长时间以来，研究者不断探索DKD的早期诊断，但仍不能确定灵敏度和特异度均理想的指标。近年来，随着组学技术的迅速发展，关于尿蛋白质组学在DKD早期诊断方面的研究取得了显著进展。通过对不同糖尿病患者尿蛋白质组的研究[10-11]证实尿Hp在早期DKD中可预测肾功能的进展。

Yang等[10]利用尿液蛋白质组学对糖尿病视网膜病变极端病例进行前瞻性分析研究。从1 544例2型糖尿病患者中筛出112例增生期视网膜病变和105例糖尿病病程大于10年而无任何程度糖尿病视网膜病变的对照组，选择其中微量白蛋白尿的患者应用尿蛋白质组学研究进行比较，发现病例组与对照组比差异有统计学意义的前两位尿蛋白为Hp和α2-巨球蛋白。在此队列研究中，210例估算肾小球滤过率(estimate glomerular filtration rate，eGFR)≥80 mL·min-1·1.73 m-2的2型糖尿病患者，基线尿Hp≥20 ng/min者，有较高的慢性肾功能不全(chronic renal insufficiency，CRI)发生率。尿Hp和微量白蛋白都低的患者CRI的发生率仅为3.2%，有微量白蛋白尿的患者CRI的发生率是9.5%，而尿Hp增高的患者CRI的发生率是13.3%。CRI发生率最高的是尿微量白蛋白和Hp均高(22.4%)的患者。该研究显示尿Hp是一种新的生物标志物，可作为尿微量白蛋白的补充，预测2型糖尿病患者的肾损害。

Bhensdadia等[11]使用液相色谱/质谱法分析8例正常白蛋白尿的2型糖尿病患者的尿液以确定预测肾功能下降的候选标志物。进一步对30例患者尿液中的7个标志物：集聚蛋白(agrin)、Hp、甘露聚糖结合凝集素-丝氨酸蛋白酶2(mannan-binding lectin serine protease 2，MBLSP-2)、溶酶体膜蛋白2(lysosomal membrane proteins 2，LAMP-2)、AGT、NGAL和尿调节素(uromodulin)进行验证，结果表明Hp是早期肾功能下降的最佳预测因子。对204例没有显著肾脏受损(eGFR≥60 mL·min-1·1.73 m-2，UACR<300 mg/g)的2型糖尿病患者的尿液进行了测定，在校正治疗组和使用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme，ACEI)后，比较每种指标的最高和最低三分位数，以HCR作为预测指标的早期肾功能下降的OR值为2.70(CI1.15，6.32)，以ACR作为预测指标的OR值为2.50(CI1.14，5.48)。将HCR结合ACR来预测早期肾功能下降的模型改善了预测性能。因此，HCR有助于预测2型糖尿病患者在发生大量蛋白尿或减少GFR之前患肾病的风险。

Liu等[12]对包括269 例肾功能不进展[每年eGFR 0.2(-0.7～1.0)mL·min-1·1.73 m-2]和 153 例肾功能进展[每年eGFR -7.1(-10.6～-5.1)mL·min-1·1.73 m-2]的2型糖尿病患者进行了前瞻性研究，证明尿Hp可预测2型糖尿病和早期肾脏疾病患者的肾功能快速下降。以eGFR每年下降≥3 mL·min-1·1.73 m-2为主要终点。基线时，与肾功能无进展者相比，进展者中尿Hp浓度增加了11倍。与最低四分位的患者相比，Hp第三和第四分位的患者肾功能进展OR分别为-2.25(1.11～-4.59)和-5.41(2.63～-11.1)倍，而白蛋白第三和第四分位的患者肾功能进展OR为-2.53(1.17～-5.51)和-9.01(4.00～-20.5)倍。Hp明显增加了蛋白尿的预测能力，优于传统危险因素。在慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)3期亚群中，尿Hp优于白蛋白尿，以预测肾功能的快速下降。

目前关于尿Hp的研究不仅局限于DKD，关于其他肾脏疾病与Hp的关系也有很多相关研究。Aggarwal等[28]对88名系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)患者和20例类风湿性关节炎、20例糖尿病和20例健康人进行研究，平均随访1.5年，根据SLE疾病活动指数(SLE disease activity index，SLEDAI)，患者被分类为活动性肾病(active renal, AR)，活动性非肾病(active nonrenal, ANR)或非活动性疾病(inactive disease, ID)。使用双向凝胶电泳，通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)对尿样进行鉴定并使用酶联免疫吸附测定进行验证，结果显示3种尿蛋白α-1抗胰凝乳蛋白酶(alpha-1 anti-chymotrypsin, ACT)、Hp和视黄醇结合蛋白(retinol binding protein, RBP)是狼疮性肾炎活动的潜在生物标志物。尿HCR在AR组最高，为2.6(0.02～338.5)ng/mg，糖尿病组的HCR为0.55 (0～4.99) ng/mg，虽然低于AR组，但显著高于ANR组[0.14(0～5.43) ng/mg]、ID组[0.17(0.01～20.62) ng/mg]、类风湿组[0.12(0.04～1.37)ng/mg]和健康对照组[0.11(0～0.71)ng/mg]。Zager等[29]比较了16名急性肾功能损伤患者的尿液样本和正常受试者或来自15名患有慢性肾病的患者的尿液样本，发现急性肾功能损伤的患者尿Hp浓度显著增高。

综合以上临床的相关研究结果，目前认为尿Hp浓度增高与肾脏的急性损伤及活动性炎性反应有关，在糖尿病患者中尿Hp浓度增高可能是早期DKD的生物标志物，具有在糖尿病患者中早期预测肾功能进展的临床价值。

3 Hp与DKD的机制探讨

人们曾经普遍认为DKD患者的主要病变在肾小球，DKD早期主要是肾小球滤过膜(包括肾小球血管内皮细胞、肾小球基底膜成分和足细胞)的改变，而近些年关于DKD中肾小管间质的病变也引起研究者的重视。一般认为尿中小分子蛋白质(相对分子质量小于白蛋白)主要来源是通过了正常肾小球过滤屏障并逃脱了肾小管摄取，而较大分子蛋白(相对分子质量大于白蛋白)的主要来源是肾小球滤过膜的改变而漏出[4]。但目前关于Hp研究[29-35]的结果表明传统观点可能夸大了肾小球受损或渗漏的作用，尿Hp的一部分来源可能是肾小管近曲小管上皮细胞自身合成和分泌。因此，关于尿Hp可能是早期预测DKD肾功能进展的生物标志物的相关机制的研究目前尚无一致结论。

目前较多证据证明尿中Hp来源于肾脏近曲小管细胞。首先多个动物水平的研究[29-33]证明Hp定位于肾脏近曲小管上皮细胞。Zager等[29]对6种急性肾功能损伤模型(缺血再灌注、甘油注射、顺铂肾毒性、肌红蛋白尿、内毒素血症和双侧输尿管梗阻)小鼠用免疫组织化学和分离的近端小管的方法检测Hp mRNA和蛋白质,发现近端小管是肾脏Hp增加的主要部位。急性肾功能损伤引起近端小管上皮细胞Hp基因发生快速、显著和持续的表达。Hp是肾损伤反应的参与者。Hp用于防止血红蛋白诱导的氧化组织损伤，主要是退化的溶酶体吞噬Hp-Hb复合物[30]，溶酶体内有过量的铁沉积，并且铁沉积仅出现在近曲小管上皮细胞而不出现在肾小球及其组成细胞或其他管状或间质细胞内[31]。其次，目前已有研究者[32-33]在糖尿病早期肾病患者肾脏活检中证实了近端肾小管溶酶体内铁沉积显著增多，且铁沉积数量与患者肾功能下降程度相关。另外，Zhao等[15]对肾近端小管上皮细胞系(HK-2细胞)进行培养，结果表明，即使在静息状态下，HK-2细胞也表达包括Hp在内的多种血浆蛋白的mRNA。ELISA法检测合成的蛋白主要分泌到细胞顶侧。当在外源细胞因子如白细胞介素-1β、白细胞介素-6、TNF-α、骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)或转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)存在下培养时， HK-2细胞血浆蛋白的mRNA表达受到不同程度的影响,基底膜外侧蛋白分泌量增高。基因表达结果证明蛋白质的翻译、生物合成和个体血浆的分泌发生在HK-2细胞中。 该研究证明肾近端小管上皮细胞不仅可以重吸收原尿中的血浆蛋白，在正常条件下和急慢性肾病中也可以分泌蛋白质，是尿蛋白的来源。上述研究结果支持尿Hp主要来源于肾近曲小管上皮细胞合成和分泌的假设。另外，Aggarwal等[28]的研究结果证明肾脏疾病患者血清和尿液Hp浓度之间缺乏相关性，提示尿Hp可能来源于肾脏。除肾小管细胞合成分泌Hp外，肾小管细胞损伤还可能导致Hp从管周毛细血管渗漏到肾小管中。含有Hp的肾小管细胞损伤脱落到尿液也可能是尿中Hp增高的原因。

另一方面，有关Hp与DKD患者肾小球病变的研究[32,34-35]也有相关证据。糖尿病患者由于血糖浓度的增高通过氧化应激致内皮功能障碍及出现溶血，从而引起细胞外Hb浓度升高[36]，游离Hb与Hp结合形成的Hb-Hp复合物被清道夫受体CD163内吞于巨噬细胞内，并最终被血红素氧化酶-1分解代谢。此外，在糖尿病患者的肾脏活组织检查和动物模型研究[37]也显示异常新血管形成可能参与DKD的发病机制。而Hp参与包括新生血管形成、内皮细胞增生和分化的生物过程[38]。在慢性炎性反应和(或)缺血应激中，升高的Hp可刺激组织修复和侧支血管生长。此外，动脉血流剪切力和氧化应激损伤会促进Hp大量合成和释放，进而促进血管壁内皮细胞迁移和动脉的重建[39]。组织损伤、修复和微血管重塑预示着快速肾功能恶化的高风险。因此，糖尿病患者血浆Hp浓度明显增高，由于DKD患者肾小球滤过屏障包括内皮细胞紧密连接、肾小球基底膜以及肾小球上皮细胞(足细胞)发生病理改变，导致肾小球滤过屏障不稳定[34-35]，可能造成Hp及Hb-Hp复合物通过其屏障[32]。

在通过在线参考数据库Nephromine(www.nephromine.org)发表的全基因组表达数据分析[40]中，对照组肾小球和肾小管间质中均有Hp mRNA表达，并且在进展性DKD患者肾小球和肾小管间质中的Hp mRNA表达均有增加，因此DKD中，Hp在肾脏的代谢可能同时受到肾小球及肾小管的影响。综上所述，DKD患者尿Hp的来源包括以下几种可能性：①炎性反应或高血糖刺激肾近曲小管上皮细胞合成及分泌Hp；②肾近曲小管上皮细胞合成Hp，肾小管细胞受损后小管细胞内Hp漏出或Hp随脱落的肾小管细胞排入尿液中；③高血糖及炎性反应导致血Hp浓度增高，肾小球滤过膜不稳定，造成Hp漏出。但目前关于Hp在肾脏代谢的机制尚未明确，需进一步深入研究。

4 展望

DKD起病隐匿，一旦进入大量蛋白尿期后，进展至终末期肾病的速度大约为其他肾脏病变的14倍。早期强化血糖、血压的控制及肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)抑制剂的有效治疗可延缓肾功能的进展[41]。因此，在糖尿病患者进行DKD早期筛查和预测其进展对于能够早期确定目标人群并给予相应的干预措施具有十分重要的临床意义。目前研究[10-12，28]显示尿Hp可以在糖尿病早期预测DKD发生发展，可能可以成为DKD早期诊断的生物标志物。这一结论尚需更多更大规模的样本研究来验证。Hp在DKD患者中在肾脏病变进展中的作用和机制也需要进一步探索。