ether-a-go-go相关基因通道在胰岛β-细胞中的作用

赵苗妙 元沙沙 李 奇 卢 晶 黄海霞 杨金奎

(1.首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科，北京 100730；2. 糖尿病防治研究北京市重点实验室, 北京 100730；3. 北京市糖尿病研究所，北京 100730；4. 首都医科大学附属北京潞河医院内分泌科，北京 101149；5. 首都医科大学基础医学院生理与病理生理学系，北京 100069；6. 首都医科大学代谢紊乱相关心血管疾病北京市重点实验室，北京 100069)

血糖浓度升高可以促进人和啮齿动物胰岛β-细胞分泌胰岛素，传统观点认为其机制为葡萄糖进入β细胞后，经过三羧酸循环代谢，胞内ATP/ADP比值升高，阻断了ATP敏感的K+通道(KATP)，这个关键通道的关闭导致膜去极化，触发了电压依赖性Ca2+离子通道开放[1]，Ca2+内流进入胞内，胞质Ca2+的上升触发胰岛素分泌[2]。在动作电位后期，胰岛β-细胞膜上的电压门控钾离子通道(voltage-gated potassium channel, Kv)开放，向胞外排出K+，使细胞膜复极化，致使电压依赖性Ca2+离子通道关闭，胰岛素分泌停止[3-4]。可见，胰岛素分泌量与胰岛β-细胞的电活动密切相关，对离子通道的调控可调节胰岛素的分泌。目前已大量应用于临床治疗糖尿病的磺脲类药物的作用位点就是KATP通道的磺脲素类受体(sulfonylurea receptor， SUR)亚基[5-6]，但是，直接抑制KATP电流的后果是产生不依赖血糖浓度的胰岛素释放，而这也导致了磺脲类药物在临床应用中的常见不良反应：低血糖。

胰岛β-细胞有众多电压门控钾离子通道(Kv)，它们的激活依赖于KATP通道的关闭引起的细胞膜电位去极化，然而胰岛β-细胞中的Kv的组成成分尚不清楚。本课题组的研究[7]显示Kv家族中的ether-a-go-go相关基因(ether-a-go-gorelated gene，ERG)通道在糖尿病的发生中发挥了重要的作用。为揭示ERG对胰岛素分泌的影响，本课题组在前期工作中构建了ERG全身基因敲除小鼠，发现血浆胰岛素浓度增加。本文通过比较相同背景下的野生型及敲除型小鼠胰岛β-细胞的电生理表型，以及小鼠体内糖耐量表型，探究ERG通道在胰岛素分泌过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

RPMI-1640培养基(不含L-谷氨酸，不含丙酮酸钠)、胎牛血清、青-链霉素均购自美国Gibco公司。记录钾离子电流的电极内液成分包括：KCl 130 mmol/L、NaCl 10 mmol/L、MgCl22 mmol/L、CaCl21.3 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、MgATP 1 mmol/L (用KOH调节pH值至7.3)；电极外液成分包括:NaCl 125 mmol/L、KCl 10 mmol/L、MgCl22 mmol/L、CaCl22 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、D-glucose 5.6 mmol/L (用NaOH调节pH值至7.4)。记录动作电位的电极内液成分包括：KCl 138 mmol/L、NaCl 10 mmol/L、MgCl21 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、MgATP 1 mmol/L (用KOH调节pH值至7.3)；电极外液成分包括:NaCl 130 mmol/L、KCl 5 mmol/L、MgCl21 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、HEPES 20 mmol/L、D-glucose 2.8 mmol/L (用NaOH调节pH值至7.4)。MgATP、EGTA、HEPES、D-glucose购自美国Sigma公司，胶原酶P购自美国罗氏公司，其余未特殊注明者为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

EPC-10膜片钳放大器购自德国HEKA公司；MP-285型三维操纵仪购自美国Sutter 公司；TE2000-U型倒置相差显微镜购自日本Nikon公司；Narishige Model PB-7电极拉制仪购自日本Narishige公司；BF150-110-10型玻璃微电极购自美国Sutter公司；Pulse8. 8数据采集软件购自德国HEKA公司；Minianalysis V6.02数据转换软件，pCLAMP9.2数据分析软件购自美国Axon公司；血糖仪及血糖试纸购自美国强生公司。

1.3 实验方法

电生理实验：颈脱臼法处死小鼠，经胰管注入500 U/mL胶原酶P溶液，37 ℃水浴消化25 min，在体视镜下用口吸管分离胰岛至完全培养基中过夜培养。第二天用胰蛋白酶溶液消化胰岛至单个细胞，用培养基重悬后接种于多聚赖氨酸处理的35 mm培养皿中。镜下通过细胞大小选取β-细胞，通过细胞电容值进行验证[8]。膜片钳实验采用全细胞记录模式。玻璃微电极在充灌电极内液后测得电极电阻2.5～5.0 MΩ，符合全细胞记录使用条件。高阻封接成功后电阻1～2 GΩ。采用负压吸引方式破膜，破膜后电阻500～600 MΩ。实验均在室温25～28℃条件下完成。

动物实验：选择5周龄，性别匹配的野生型(wild type, WT)与ERG基因敲除型(knockout, KO)小鼠，实验前空腹8 h以上，经腹腔注射2 g/kg葡萄糖溶液，分别在空腹、注射后15、30、60、120 min经尾静脉取血测量血糖值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 ERG基因敲除鼠胰岛β-细胞钾离子电流减低

将胰岛β-细胞膜电位钳制在-70 mV、时长0.5 s，后予-70～+70 mV、时长0.5 s的系列去极化刺激，阶跃为10 mV，最后恢复至静息电位-70 mV，时长0.5 s，详见图1A。可观察到随电压升高呈现先迅速升高后上升延缓的电压依赖性钾离子电流(Kv)的总和。各电压下钾离子电流的稳态值大小反映了该电压下钾离子通道开放的程度，结果显示所记录到的Kv电流具有弱的内向整流性特性。在该刺激条件下，KO组胰岛β-细胞Kv电流较WT组Kv降低，详见图1B、C。为排除细胞大小对实验的影响，分别以各电压下Kv电流的密度pA/pF对测试电压做I-V曲线，详见图2A。发现当测试电压高于0 mV后，KO组电流较WT组有下降趋势，0 mV: WT组为(34.88±5.263)pA/pF, KO组为(22.1±2.828)pA/pF(P=0.091 7)；测试电压达40 mV后，两组电流幅度差异有统计学意义， WT组为(103.4±11.95)pA/pF, KO组为(65.94±9.04)pA/pF(P<0.05);70 mV: WT组为(138.1±17.68)pA/pF, KO组为(86.24±13.54)pA/pF(P<0.05)，详见图2B、C、D。计算各测试电压下KO组和WT组Kv电流幅度比值可知，ERG钾通道电流约占全部Kv的37.8%。

图1 WT和KO两组小鼠原代培养胰岛β-细胞钾离子电流的比较Fig.1 Comparison of potassium currents in primary cultured pancreatic β-cells between WT and KO

A: voltage clamp protocol;B: representative voltage-dependent K+(Kv) currents of WT;C: representative Kv currents of KO;WT: wild type;KO: knockout.

图2 两组小鼠胰岛β-细胞钾电流的I-V曲线及相关标化数据比较Fig.2 I-V curve and the normalized data of potassium currents in pancreatic β-cells in the two groups of mice

A: I-V curve of Kv currents of the two groups of mice (8 cells from 3 WT mice; 5 cells from 3 KO mice);B: summary of the mean current density of Kv channels at 0 mV;C: summary of the mean current density of Kv channels at +40 mV;D: summary of the mean current density of Kv channels at +70 mV;*P<0.05vsWT group;WT: wild type;KO: knockout.

2.2 ERG基因敲除鼠胰岛β-细胞动作电位时程延长

记录一过性动作电位，发现KO组动作电位时程较WT组延长，详见图3A。计算从电流刺激开始时间点到复极化至90%的时间点距离，作为动作电位时程90(action potential duration 90%，APD90)。KO组(13.96±0.31)ms APD90较WT组(9.50±0.61)ms明显延长，但两组静息电位[(-60.50±2.47)mVvs(-61.00±2.27)mV]及动作电位幅度[(97.00±6.14)mVvs(91.74±6.20)mV]比较差异无统计学意义(P=0.848，0.610)，详见图3B、C、D。

2.3 ERG基因敲除鼠腹腔注射葡萄糖耐量实验血糖值更低

高糖刺激后，诱发胰岛β-细胞产生动作电位，促使胰岛素囊泡分泌。动作电位时程长短与胰岛素分泌多少密切相关。笔者在小鼠体内进行腹腔注射葡萄糖耐量实验，注射葡萄糖后60 min，KO组小鼠血糖较WT组小鼠血糖值降低，至注射后120 min时差异有统计学意义，WT组为(24.00±3.19)mmol/L, KO组为(13.26±4.04)mmol/L(P<0.05),详见图4。本结果证实了KO组小鼠拥有更好的糖耐量功能低。

图3 两组小鼠胰岛β-细胞动作电位及相关标化数据的比较Fig.3 Action potential curve and the normalized data of potassium currents in pancreatic β-cells in the two groups of mice

A: action potential of mouse pancreatic β-cells;B: 90% of action potential duration of WT and KO (6 cells from 3 WT mice; 4 cells from 3 KO mice);C: action potentials magnitude of WT and KO;D: resting membrane potential of WT and KO；* *P<0.01vsWT group;WT: wild type;KO: knockout.

图4 两组小鼠胰岛腹腔注射葡萄糖耐量实验Fig.4 Intra-peritoneal glucose tolerant test in the two groups of mice.

*P<0.05vsWT group;WT: wild type;KO: knockout.

3 讨论

本研究通过比较KO鼠与WT型小鼠胰岛β-细胞电生理特性，证实了ERG敲除鼠电压门控钾离子电流显著减低，说明ERG通道是组成Kv的重要离子通道成分，约占全部Kv的37.8%。电压门控钾离子电流在胰岛β-细胞复极化过程中发挥主要作用，在电流钳模式下，给予细胞500 pA，50 ms电流刺激[9]，记录一过性动作电位，发现KO鼠胰岛β-细胞动作电位时程明显延长，但静息电位及动作电位幅度较WT组无明显变化，说明ERG通道在调节动作电位时程中发挥重要作用，这同其在其他组织，如心肌细胞中，帮助细胞复极化的作用相一致[10-11]。最后，在腹腔注射葡萄糖耐量实验中，KO鼠的血糖较WT组血糖降低，间接说明了KO组小鼠胰岛素分泌水平更高，因而高糖刺激后，KO组血糖浓度较，电压门控钾离子电流在胰岛β-细胞复极化过程中发挥主要作用，在电流钳模式下，给予细胞500 pA，50 ms电流刺激[9]，记录一过性动作电位，发现这说明ERG通道通过影响胰岛素分泌，而在调节血糖浓度中发挥了重要的作用。

ERG通道是可兴奋细胞膜上内向整流钾离子通道的重要组成部分，存在于心肌、胰腺、肠道等多种细胞当中，近期的研究[12]表明，ERG通道对于血糖的调节发挥了至关重要的作用，但是其确切的分子机制尚不得而知。本课题组的研究结果表明，β-细胞膜上的ERG通道可引起β-细胞动作电位时程的延长，进而增加胰岛素的分泌量[13]，这也同本研究中动物体内KO鼠的血糖浓度更低的结果相一致。

值得一提的是，ERG通道的开放发生于KATP通道关闭之后，而KATP的关闭依赖于体外血糖浓度的上升，由此可知，ERG通道的作用间接依赖于体外血糖浓度的上升。

迅速增多的糖尿病患者正在成为一个重要的健康问题，在中国影响了1.144亿人，居全球第一[14]。伴随着肥胖的发病率增加，2型糖尿病在未来很可能变得更加普遍。它严重影响生命质量并造成大量患者死亡，同时消耗了过多的公共卫生保健系统资源。经典磺脲类降糖药的致低血糖不良反应使得临床医生在用药时需要严格掌控剂量，而这也有赖于长年的临床经验积累。研发新型不产生低血糖风险的口服降糖药的任务至关重要。而本研究的结果表明，ERG通道可作为一种新型的糖尿病治疗靶点，抑制ERG通道钾离子电流可产生依赖于血糖的降糖作用，不增加低血糖的风险。这为今后研发新型降糖药物提供了分子机制基础，也为将电压门控钾离子通道(Kv)作为降糖药物靶点提供了依据，为新药研发打开了新思路。

感谢首都医科大学中心实验室机能学研究平台在膜片钳实验中给予的支持。