高抑菌活性物质产生菌的选育、优化及其特性表征

李 勋，周楠迪，田亚平

（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

抗生素是全球最广泛使用的抗菌药物，但其在医药与畜牧方面的过度使用造成严重后果，耐抗生素细菌的出现，使得抗生素的使用面临严重挑战[1-2]，因此，寻找可代替传统抗生素药物且对人体与环境无毒害、无残留的天然抑菌物质成为研究热点，细菌素独特的优点，使其成为抗生素类药物替代品的首要选择，在生物饲料添加剂、微生态制剂[3]、生物药品等领域具有较好的应用前景[4]。细菌素是由某些细菌代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白复合物[5]。芽孢杆菌（Bacillus）在自然界中分布广泛，生理特性丰富，能够产生酶类、胞外杆菌肽、大环内酯、类噬菌体颗粒等多种拮抗物质[5-6]。

地衣芽孢杆菌能够代谢产生多种物质，在工业和医药业中应用较多，是一种具有极高应用价值的微生物[7]。地衣芽孢杆菌产抑菌活性物质种类较多，其中，抗菌肽因其可作为抗生素的替代品，受到重视。Mendo 等[8]报道地衣芽孢杆菌189 可产生抑菌多肽，可以抑制革兰氏阳性菌株的生长。樊陈[1]等从地衣芽孢杆菌发酵液中分离出一种具有广谱抑菌效果的抗菌肽，该抑菌肽对革兰氏阳性菌株抑制效果优于革兰氏阴性菌株。纪兆林等[9]对地衣芽孢杆菌培养条件进行优化，抑菌率提升了34.6%，并从发酵液中分离出一种稳定性高的抑菌肽。

本研究从实验室保藏菌株中筛选出一株高抑菌活性物质产生菌，对其菌落形态、生理生化特征与16S rRNA 基因水平鉴定。通过单因素试验与正交试验，确定其最适发酵培养基与培养条件。使用硫酸铵分级盐析与离子交换层析对发酵液中抑菌物质进行分离，并对分离纯化所得抑菌物质的特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 实验室保藏菌株JN-814B、JN-814C、JN-814D、JN-814E、JN-814、JN-814G、JN-814LX、凝结芽孢杆菌ACCC10229、凝结芽孢杆菌CICC21736、凝结芽孢杆菌0076（T）。

1.1.2 指示菌株 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtillis）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginose）、大肠杆菌（E.coli）、酵母菌（Yeast）、黑曲霉（Aspergillus niger）。

1.1.3 培养基 LB 培养基；YPD 培养基；PDA 培养基。固体培养基向其中添加1.5%～2%琼脂粉。

初始培养基：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性物质的检测 采用管碟法[10]检测抑菌活性物质。

1.2.2 目的菌株的选育 将实验室保藏菌株分别活化后，接种入LB 培养基，适宜条件下培养12 h，发酵液10 000 r/min，4 ℃离心20 min，以金黄色葡萄球菌为指示菌，以管碟法测定上清液对其的抑制作用，选择抑菌效果最佳的菌株作为目标菌株。

1.2.3 发酵培养基的优化 采用单因素实验，将初始培养基中碳源葡萄糖分别替换为蔗糖、乳糖、麦芽糖、环糊精、玉米淀粉，将其中氮源物质胰蛋白胨替换为鱼粉蛋白胨，豆饼、豆粕、硫酸铵、尿素，将其中无机盐分别替换为氯化钾，磷酸氢二钾，磷酸氢二钠，硫酸镁。分别对单因素优化出的3 个营养元素与酵母粉进行添加量优化。根据优化结果，设置3个水平对其进行L9（34）正交试验。

1.2.4 发酵条件的优化 使用优化后的培养基进行发酵，在其他条件不变的情况下，分别对发酵初始pH，装液量，发酵温度，接种量，发酵时间进行优化。

1.2.5 优化结果的验证 为验证培养基与培养条件优化结果的可靠性，对优化后的培养基组成与培养条件进行验证，分别以优化前与优化后进行发酵培养，检测发酵液上清液的抑菌效果。

1.2.6 抑菌效价的计算 抑菌效价计算采用管碟法：二剂量法[11]。

1.3 抑菌活性物质的分离纯化

1.3.1 硫酸铵分级盐析[12]将发酵液离心，取上清液，分别向其中添加硫酸铵至饱和度为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，离心，取沉淀，将沉淀溶于50 mmol/L，pH 6.8 的Tris-HCl 缓冲液中，将溶解液置于缓冲液中透析除盐[13]，检测透析液的抑菌活性[14]。

1.3.2 DEAE-Sephrose-FF 阴离子交换层析 硫酸铵沉淀后的溶解液，DEAE-Sephrose-FF 阴离子交换层析柱经0.05 mmol/L，pH 6.8 的Tris-HCl 缓冲液平衡后，上样量1 mL，使用0%、27%、46%、100%1 mol/L NaCl Tris-HCl 缓冲液进行梯度洗脱，检测波长280 nm，收集各峰组分并浓缩，检测其抑菌活性[15]。

1.4 抑菌肽的特性研究

1.4.1 抑菌肽蛋白酶敏感性 取阴离子交换分离后的抑菌活性物质样品，分别置于6 支试管中，调节pH 至所用蛋白酶最适pH，分别加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、亮氨酸氨肽酶，脯氨酸氨肽酶，使酶的最终浓度为10 mg/mL，对照组添加无菌水，在各酶最适温度水浴30 min 后调pH 至中性。检测各组样品抑菌活性。

1.4.2 抑菌肽氨基酸组成分析 对离子交换后所得抑菌肽进行浓盐酸水解，高效液相色谱检测水解后样品中的氨基酸组成，与未经水解的样品进行对比，获得目标抑菌肽的氨基酸组成。

1.4.3 抑菌肽温度稳定性 取阴离子交换分离后的抑菌活性肽样品，配置成0.02 g/mL 溶液，放入离心管中，分别置于50，60，70，80，90，100 ℃条件下水浴20 min，冷却至室温后测定抑菌活性。

1.4.4 抑菌肽pH 稳定性 取7 管阴离子交换分离后的抑菌活性肽样品，使用0.05 mol/L 的NaOH 溶液与0.05 mol/L HCl 分别调整pH 4～10，37 ℃处理12 h，调整pH 至7.0 后测定其抑菌活性

1.4.5 抑菌肽抑菌谱 将硫酸铵初步分离得到的抑菌肽分别对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、酵母等菌株做抑菌活性检测。

2 结果与分析

2.1 抑菌活性物质产生菌的选育

2.1.1 目的菌株的选择 将实验室保藏的10 株菌发酵液上清液抑菌效果如图1 所示。其中，菌株JN-814C 抑菌圈直径最大，对金黄色葡萄球菌抑制效果最明显，故选择菌株JN-814C 为抑菌活性物质产生菌进行研究。

2.1.2 菌株JN-814C 的鉴定 菌株JN-814C 在LB培养基上生长良好，菌落为浅黄色圆形菌落，不透明，表面光滑，菌落边缘呈不规则状。其生理生化特征见表1。

对菌株JN-814C 进行16S rRNA 测序，将所测得的序列与Genbank 中的16S rRNA 相似性进行比较。菌株JN-814C 与Bacillus chenifoormis 的16S rRNA 序列同源性达到99%以上。

综合生理生化鉴定和16S rRNA 测序结果，可以认为菌株JN-814C 为地衣芽孢杆菌（Bacillus cheniformis）的一个亚种。

图1 实验室保藏菌株发酵液上清液抑菌效果Fig.1 Antibacterial results of differernt bacterial strains preserved in the laboratory

2.2 菌株JN-814C 产抑菌活性物质的优化

2.2.1 菌株JN-814C 细胞生长与发酵曲线 由图2 可知，菌株JN-814C 接种入发酵培养基后即开始产生抑菌活性物质，在22 h 时分泌产物抑菌圈直径达到最大值，抑菌净直径约为23 mm，发酵30 h 以后，由于培养基中营养物质被消耗，不利于代谢产物积累，发酵液中活菌数量也逐渐减少，同时，产物抑菌圈直径开始逐渐下降，发酵液中抑菌活性物质的量开始减少。因此推断抑菌活性物质主要产生于菌体生长的对数期，在发酵后期抑菌活性物质的减少可能与菌体分泌蛋白酶有关。故选择22 h 作为发酵培养周期。

图2 菌株JN-814C 产抗菌物质的发酵曲线Fig.2 Fermentation curve of strain JN-814C for an antibacterial substance productionan antibacterial substance production

2.2.2 发酵培养基的确定 由图3 可知，培养基最佳碳源、氮源、无机盐分别为糊精、胰蛋白胨、硫酸镁。其最适添加量分别为糊精0.5%，胰蛋白胨0.5%，硫酸镁0.1%。培养基成分正交优化结果见表2。

经单因素试验与正交试验，确定培养基中各因素影响大小依次为A＞C＞B＞D，最优培养及配方为糊精5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L，硫酸镁3 g/L。

2.2.3 培养条件的确定 培养条件产抑菌物质的抑菌活性的影响见图4。

1）种子培养时间的确定。由图4（a）可以看出，种子培养时间最佳为22 h，此时菌体生长处于对数末期，菌体生长速率与菌体数量均处在较高水平，故选择种龄为22 h。

2）培养温度对抑菌效果的影响。使用优化后的培养基，分别在25、28、31、34、37、40、43 ℃温度条件下进行发酵培养，检测发酵液上清液抑菌效果。由图4（b）可知，温度对发酵上清液抑菌效果影响较大，低温和高温都不利于抑菌活性物质的产生，在37 ℃时，分泌产物抑菌圈直径大到最大，所以选择37 ℃作为发酵的培养温度。

3）初始pH 对抑菌效果的影响。将发酵培养基的pH分别调整为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，培养22 h 后检测发酵上清液的抑菌效果。由图4（c）可知，在pH 范围为6.0～9.0 内，培养基初始pH对发酵液抑菌效果基本无影响。

4）装液量对抑菌效果的影响。分别向250 mL锥形瓶中添加20、30、40、50、60、70、80 mL 培养基，培养后测定发酵上清液的抑菌效果。由图4（d）可知，装液量在50 mL 以内时，随着装液量增加，上清液抑菌圈直径逐渐增大，装液量超过50 mL 以后，上清液抑菌圈直径迅速下降，在装液量50 mL 时分泌产物抑菌圈直径最大，抑菌效果最佳，故选择50 mL 作为发酵过程装液体积。

图3 培养基成分对产抑菌物质的抑菌活性的影响Fig.3 Effects of carbon source on antibacterial activity

表2 培养基成分正交优化结果Table 2 Orthogonal test results of medium composition

图4 培养条件产抑菌物质的抑菌活性的影响Fig.4 Effects of fermentation conditions on antibacterial activity

5）接种量对抑菌效果的影响。由图4（e）可以看出，接种量在1%～10%范围内时，接种量大小对发酵液抑菌效果影响较大，接种量在2%时，抑菌圈最大，发酵液的抑菌效果最佳，随着接种量增大，上清液抑菌圈直径呈减小趋势。

6）优化结果的验证。为验证培养基与培养条件优化结果的可靠性，对优化后的培养基组成与培养条件进行验证，分别对优化前与优化后进行发酵培养，检测发酵液上清液的抑菌效果。结果如图5 所示。

优化后发酵液上清液抑菌效果得到提高，通过计算，优化后发酵液抑菌效果较未优化的发酵液抑菌效果提高41.4%。

图5 不同发酵条件下的抑菌效果Fig.5 Bacteriostatic effects of different fermentation conditions

2.3 抑菌活性物质的分离纯化

2.3.1 硫酸铵沉淀粗提取 硫酸铵盐析如图6 所示。由图6 可知，菌株JN-814C 的发酵上清液经硫酸铵分级盐析浓缩后，抑菌活性物质主要集中在硫酸铵饱和度为40%～70%的范围之内，在70%～80%范围内抑菌活性物质的量减少，说明该菌株所产抑菌性物质可被硫酸铵沉淀，具有蛋白性质，为保证抑菌活性物质的收率，选择硫酸铵饱和度40%～80%作为上清液处理浓度。

图6 硫酸铵盐析Fig.6 Ammonium sulfate salting-out

2.3.2 DEAE-Sepharose-FF 阴离子交换层析分离选用DEAE-Sepharose-FF 对硫酸铵粗提液进行分离，收集阴离子交换层析洗脱的个各峰组分，富集浓缩后测定其抑菌能力，结果抑菌性物质分布于峰a 与峰b，其中，a 峰为穿透峰，峰b 为27%NaCl 洗脱峰，分别收集峰a 与峰b，冷冻干燥得到纯化的抑菌肽。

图7 DEAE-Sepharose-FF 离子交换图谱Fig.7 DEAE-Sepharose-FF anion exchange chromatogram

图8 层析出峰的各峰抑菌效果Fig.8 Bacteriostatic spectrum of the three fractions

2.4 抑菌物质的特性研究

发酵液中抑菌活性物质经硫酸铵沉淀与DEAE阴离子交换层析后得到分离，表现出一定的蛋白性，对其进行蛋白酶处理。

2.4.1 蛋白酶敏感性 蛋白酶对抑菌活性的影响如图9 所示。由图9 可知，纯化后的抑菌活性物质经7 种蛋白酶处理后，碱性蛋白酶对其抑菌活性影响较大，其次为亮氨酸氨肽酶，结果表明该抑菌物质是多肽类物质，其肽链N 端存在亮氨酸残基。

图9 蛋白酶对抑菌活性的影响Fig.9 Effects of proteases on antimicrobial activity

表3 抑菌肽的抑菌谱Table 3 Antibacterial spectrum of antimicrobial peptide

2.4.2 抑菌肽氨基酸组成 抑菌肽氨基酸的组成如表4 所示。氨基酸分析表明，分离出的抑菌肽主要含有9 种氨基酸，其中谷氨酸的含量处于较高水平。

表4 抑菌肽氨基酸组成Table 4 Amino acid composition of antimicrobial peptide

2.4.3 热稳定性 温度对抑菌活性的影响如图10所示。由图10 可知，纯化后的抑菌肽经不同温度处理，在80 ℃以内时，抑菌效果保持在较高水平，且相对稳定，超过80 ℃以后，抑菌效果明显下降，说明该菌株所产抑菌肽具有一定的温度耐受性，但对80 ℃以上高温耐受性较差。

图10 温度对抑菌活性的影响Fig.10 Effects of temperature on antimicrobial activity

2.4.4 pH 稳定性 将纯化后抑菌肽样品在不同pH条件下处理后，抑菌性实验结果如图11 所示，从图11 可以看出抑菌圈直径变化较小，说明在pH 4～10范围内，该细菌素活性较为稳定。

图11 p H 对抑菌活性的影响Fig.11 Effects of pH on antimicrobial activity

2.4.5 抑菌肽抑菌谱的测定 抑菌肽的抑菌谱如表3 所示。结果表明，分离所得抑菌肽对革兰氏阳性菌表现出很好的拮抗性，对革兰氏阴性菌及真菌无抑制作用。

3 结语

本研究筛选出一株产抑菌活性物质较高的菌株，地衣芽孢杆菌JN-814C，通过发酵优化，将其抑菌效价提高41.4%，对发酵液中抑菌活性物质进行分离纯化后，通过蛋白酶处理与氨基酸分析确定其为一种抑菌肽，研究表明，该抑菌肽稳定性较好，其对革兰氏阳性菌有较好的抑制作用，与文献报道一致。