顶空毛细管气相色谱法同时测定磷酸特地唑胺原料药中4种有机溶剂的残留量

吕丹 唐克慧 王宇弛 张春然 王瑛瑛 张静霞 王术兰

(成都大学四川抗菌素工业研究所，成都 610052)

磷酸特地唑胺(tedizolid phosphate)，化学名为(R)-3-{4-[2-(2-甲基四唑-5-基)吡啶-5-基]-3-氟苯基}-5-羟甲基噁唑烷-2-酮磷酸酯，是一种噁唑烷酮类抗生素[1-2]。2014年上半年，磷酸特地唑胺获得美国食品药品管理局(FDA)批准，用于治疗由某些敏感革兰阳性菌引起的急性细菌性皮肤及皮肤组织感染(ABSSSI)的第二款新型抗菌药物[3]。其作为具有新型化学结构的抗菌药物用于治疗革兰阳性菌感染有巨大的市场需求。和利奈唑胺相比，具有增加药效和缩短治疗持续时间的双重优势[4-5]。经查阅文献发现，目前该品种国内外药典均未收载。近两年来，国内外关于磷酸特地唑胺的含量测定和有关物质检测有少量报道[6-9]，而关于测定磷酸特地唑胺原料药中有机溶剂残留量在国内外均未见到文献报道，磷酸特地唑胺在合成工艺中使用了有机溶剂甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和二氧六环等有机溶剂[8]。二氯甲烷属于第一类溶剂，二氧六环和甲醇属于第二类溶剂，乙酸乙酯属于第三类溶剂，出于对人体安全的考虑，需要对这些残留溶剂加以控制。本研究基于中国药典2015年版(四部)“通则0861”[10]和人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)中有机溶剂残留量指导原则[11]，建立了磷酸特地唑胺原料药中甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和二氧六环残留量的顶空气相色谱检测方法，希望为控制磷酸特地唑胺原料药的残留有机溶剂提供一定的参考[12-16]。

1 材料

1.1 仪器

Aglient 7890A型全自动气相色谱仪、Aglient G1888顶空全自动进样器、FID(氢火焰离子化检测器，美国Agilent公司)、ChemStation在线色谱工作站；Agilent DB-624色谱柱(30m×0.53mm, 3.0μm)，KQ-100B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Sartorius BP211D型天平(赛多利斯公司)。

1.2 药品与试剂

磷酸特地唑胺原料药(四川大学华西药学院自制，批号：170901、170902和170903)；甲醇对照品(色谱纯，批号：A160800Z492)、二氯甲烷对照品(色谱纯，批号：72009)、乙酸乙酯对照品(色谱纯，批号：75924)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF，色谱纯，批号：91D1511PM)均购自德国Merck公司，二氧六环对照品(分析纯，批号：2016041301)购自成都市科龙化工试剂厂，纯度均≥99.8%。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Aglient DB-624毛细管柱(30m×0.53mm,3.0μm)为本方法色谱柱；检测器：氢火焰离子化检测器(FID)；进样口温度设置为200℃；FID检测器温度设置为250℃；柱温采取程序升温方式：起始柱温设置为50℃保持5min，然后以15℃/min升温至220℃后再保持5min；载气使用高纯N2，其柱流速为3.0mL/min；分流比设置为5:1；进样方式为顶空进样；顶空进样体积为1.0mL；顶空瓶装样量为10mL；顶空瓶温度设定为100℃；顶空平衡时间设置30min。

2.2 溶液的配制

2.2.1 空白溶液(稀释剂)

精密量取DMF 1mL，置于10mL顶空瓶中密封保存备用。

2.2.2 混合对照品溶液

精密称取甲醇150mg、二氯甲烷30mg、乙酸乙酯250mg、二氧六环对照品各19mg，分别用DMF稀释至10mL，作为单个对照溶液，备用；分别精密量取2mL单个对照品溶液于50mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，再摇匀后作为混合对照品储备液；精密量取2.5mL混合对照品储备液于量瓶中，加DMF稀释至10mL，再摇匀后作为混合对照品溶液。取1mL置于10mL顶空瓶中，加盖密封保存备用。

2.2.3 供试品溶液

精密称定本品适量，加DMF溶解并定容，超声助溶5min使之溶解，摇匀，制成含50mg/mL的供试品溶液，备用。精密量取1mL供试品溶液于10mL顶空瓶中，加盖密封即得，备用。

2.3 系统适用性试验

分别精密量取“2.2.2”项下单一对照品溶液1.0mL，在“2.1”条件下进样测定，对各待测组分在Aglient色谱工作站所得色谱图中进行定位检测。另精密量取“2.2”项下空白对照溶液、混合对照品溶液、供试品溶液，同法测定，记录色谱图样报告，所得空白溶剂、混合对照品溶液及供试品溶液气相图谱为图1。由图1可见，在本实验的色谱条件下，各待测组分相互无干扰，均能达到良好的分离，峰形良好，分离度＞1.5，理论塔板数均大于50000；甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六环、DMF的保留时间分别为2.975、3.885、4.544、5.715和7.224min。由此可见，该方法系统适用性符合要求。

图1 气相色谱图Fig.1 The GC chromatograms

2.4 线性关系考察

精密量取混合对照品储备液(“2.2.2”项下制得的备用溶液)0.1、0.5、1.0、2.5、5.0和10mL，分别置于量瓶中，加DMF稀释至10mL作为系列标准曲线混合对照测试溶液，依次取上述溶液1.0mL于顶空瓶中，加盖密封，再采用本实验色谱条件(“2.1”项下)同法进样测定分析，分别记录各个系列的色谱峰面积。以各个对照品的质量浓度ρ(μg/mL)为横坐标，以与之相对应的峰面积(A)为纵坐标在Excel办公软件中进行线性回归分析，分别得到甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六环的标准曲线线性回归方程及线性范围，结果见表1。

表1 4种残留溶剂的线性方程和线性范围Tab. 1 Linear regresstion equations and their concentration range of four residual solvents

2.5 定量限与检测限的测定

精密量取混合对照品溶液(“2.2.2”项下)，采用逐级稀释法，采用本实验设定的色谱条件(“2.1”项下)同法进行检测，记录S/N(信噪比)，当S/N约为10:1时计算出定量限(LOQ)；当S/N约为3:1时计算出检测限(LOD)，检测结果见表2。

表2 LOQ与LOD检测结果Tab. 2 Determination results of LOQ and LOD

2.6 精密度试验

秘密量取混合对照品溶液1mL于顶空瓶中，加盖密封，采用本实验色谱条件同法进行分析，连续重复进样测定6次，计算甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六环峰面积的RSD分别为0.65%、1.12%、0.73%和1.36%(n＝6)。残留有机溶剂组分的RSD均小于2%，说明本方法精密度良好。

2.7 稳定性试验

制备供试品溶液(批号：170901)6份，分别放置室温下0、1、2、4、6和8h时后采用本实验色谱条件同法进行检测分析，记录色谱峰面积。结果本品中二氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六环均未检出，只检出甲醇，其峰面积的RSD为1.15%(n＝6)，表明本溶液在8h内(室温)稳定。

2.8 重复性试验

同一分析人员平行制备6份供试品溶液(按“2.2.3”项下方法)，精密称取本品(批号：170901)约50mg，共6份，分别置于10mL顶空瓶中，在上述相同色谱条件下进行分析检测，记录峰面积并计算这6份供试品溶液中有机溶剂的残留量。检出本品中甲醇残留量的平均值为0.01%，RSD为0.63%(n=6)，其他成分未检出，说明本实验采用的方法重复性较好。

2.9 回收率试验

精密称定已知的各组分含量的磷酸特地唑胺(批号：170901)50mg，分别置于10mL顶空瓶中，共9份。加入各溶剂限度的80%、100%和120%质量的待测组分的相应的单一对照品，各3份，在本实验设定的条件下同法测定(“2.2.3”和“2.1”项下)，记录峰面积并用外标法计算甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六环的加样回收率。再分别统计平均回收率依次为104.83%、98.79%、102.65%和97.12%，RSD依次为0.92%、1.64%、0.70%和1.72%(n=9)，结果表明，本研究采用的检测方法的准确度良好。

2.10 样品中有机溶剂残留量的测定

分别取3批磷酸特地唑胺原料药(批号分别为170901、170902和170903)各50mg，采用本实验方法(“2.2”和“2.1”项下)进样分析，并用外标法计算3批磷酸特地唑胺原料药中甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六环的残留量，结果见表3。

表3 磷酸特地唑胺中有机溶剂残留量检测结果(n=3, %)Tab. 3 The test results of residual organic solvents of tedizolid phosphate (n=3, %)

根据中国药典2015年版四部规定，甲醇限度为0.3%，二氯甲烷限度为0.06%，乙酸乙酯限度为0.5%，二氧六环限度为0.038%。检测结果显示3批样品中均只检出甲醇残留，残留均未超过限度。

3 讨论

3.1 溶剂的选择

磷酸特地唑胺原料药的水溶性较差，若用水作溶剂某些残留有机溶剂可能会被包埋在未溶解的固态磷酸特地唑胺样品中，导致进样浓度不精确，故不宜选择水作为溶剂。而磷酸特地唑胺原料药在DMF(N, N-二甲基甲酰胺)和DMAC(N, N-二甲基乙酰胺)中溶解性好，但DMF比DMAC价格更便宜，4种待测有机溶剂在DMF有较好的溶解性，DMF出峰在4种待测有机溶剂之后不会干扰测定结果，且溶解于DMF中各残留溶剂均能达到良好的分离，故选择DMF作为溶解样品的溶剂及稀释剂[17]。

3.2 色谱柱的选择

本研究分别选用HP-5、DB-1、DB-4、DB-wax和DB-624毛细管柱进行实验，结果显示采用DB-624毛细管柱进行分离时，分离效果最好，峰形最尖锐且对称，灵敏度较高，故本试验选用DB-624毛细管柱为色谱柱。

3.3 顶空平衡温度的考察

顶空平衡温度越高，顶空瓶内的饱和蒸气压越高，挥发气体的浓度越高，灵敏度就相应越高。但是温度过高可能会损坏顶空进样瓶导致瓶口漏气，使得待测成分浓度不准确，以及某些物质可能会产生降解产物影响测定的结果[18]。当平衡时间为30min时，本课题组比较了顶空平衡温度60、70、80、90、100、110和120℃下的待测溶剂的峰面积，发现色谱峰面积随着平衡温度的升高而升高，但在100℃以上的色谱峰面积增加不明显，当温度升至110℃时，有少量未知降解杂质出现，考虑到在100℃各待测有机溶剂都能检出且有良好的响应，故本实验的顶空平衡温度设置为100℃。

3.4 顶空平衡时间的考察

顶空平衡的时间要能保证样品溶液中的气液两相达到平衡，当顶空平衡温度为100℃时，本课题组比较了顶空平衡时间5、10、20、30、40、50和60min时的色谱峰面积，在5～30min，色谱峰面积逐渐增大，30～60min时峰面积几乎不再增加，可见在30min时各待测有机溶剂已在气液两相间达到平衡，考虑到平衡时间不宜过长，在30min条件下也无杂质干扰测定结果，故本试验选择30min作为顶空平衡时间。

4 结语

本研究首次通过顶空毛细管气相色谱法测定磷酸特地唑胺原料药中的4种残留有机溶剂，并对其进行了方法学验证。结果表明，在本实验设定的色谱条件下，各残留溶剂之间分离效果好，灵敏度高，在浓度范围内线性良好，回收率符合规定。该顶空气相色谱研究方法快速、简便、经济、灵敏，准确、精密度和重现性良好，适合磷酸特地唑胺原料药中甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和二氧六环等有机溶剂的残留量的同时测定，可以为药物分析工作者对磷酸特地唑胺原料药中残留溶剂的质量控制提供一定的参考。