外泌体的研究进展

宋赛赛，贺娇，程琳

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450008；2.陕西省精神卫生中心，陕西 西安 710061）

0 引言

外泌体是由机体大多数细胞分泌的。1983 年，Johnstone[1]等首次在网织红细胞中发现外泌体的。研究人员在观察转铁蛋白受体的活动时，发现在网织红细胞成熟期间，转铁蛋白受体被打包，并且被网织红细胞分泌到胞外小泡中。便认为它是网织红细胞中的物质被溶酶体破坏后分泌到胞外的垃圾。尽管外泌体发现的较早，但是由于人们对外泌体的认识还不足，所以在过去的几十年里，它不受研究人员的关注。据最早报道，部分研究人员认为外泌体主要由免疫细胞（树突状细胞、T 细胞、B 细胞巨噬细胞）与肿瘤细胞分泌的。但是人们对外泌体的了解也更深入，更全面，认识到外泌体是包括肿瘤细胞在内的大多数细胞分泌的囊泡小体，血液，尿液等体液均能检测到外泌体[2]。并发现其具有一定的生物学活性，它能够在血管之间自由移动，参加细胞与细胞之间沟通，参与凝血，血管生成等活动。因此，近几年，研究人员掀起了研究外泌体的热潮。

1 外泌体的组成

由胞内分泌到胞外的小囊泡，称为胞外囊泡。囊泡有三大类，根据直径的大小及形态学差异，囊泡分三种，直径由小到大顺序依次为：外泌体（40-100 nm)，微泡(100-1000 nm)，凋亡小体(1000-5000 nm)[2]。外泌体直径与病毒直径范围接近，约40-100 nm，密度在1.10-1.18g/mL，使用蔗糖密度梯度离心法提取外泌体时，外泌体可以在密度为1.13-1.19 g/mL 的蔗糖中沉降。电镜下，外泌体主要为杯形，杯形形状可能是由于样品制备中外泌体脱水裂解而形成的。但是在体液中，球形结构为其在体液中的主要形态。外泌体具有脂质双分子层结构，其主要由蛋白质，脂质，核酸组成，但是外泌体内部缺乏高尔基体，内质网等活细胞内部存在的细胞器[3]。

1.1 外泌体所含蛋白质

外泌体来源很广，种类繁多，外泌体的母代细胞可以决定外泌体蛋白的成分及含量。

外泌体中蛋白质分子，一部分为常见蛋白，出现在所有外泌体中。如细胞骨架蛋白（微管蛋白，肌动蛋白），四跨膜蛋白（CD9，CD63），脂质相关蛋白，热休克蛋白家族（HSP90）等。另一部分蛋白和细胞来源相关，如与内膜系统转运相关的蛋白ALIX，Tsg101 及ESCRT 家族蛋白等，但外泌体不含有内质网蛋白如钙联蛋白Calnexin。因此我们可以使用CD63,CD9 以及钙联蛋白衡量外泌体提取方法是否可行，以及判断使用此方法提取的外泌体纯度是否可靠，如提取外泌体后进行蛋白免疫印迹法，若在CD63 或者CD9 等外泌体通用蛋白的相应位置上出现条带，则证实提取到外泌体，若存在内质网蛋白如钙联蛋白，则在其分子量相应的位置上出现条带，则证实提取的外泌体不纯，若无条带，则证实此种提取方法获取的外泌体纯度高。

此外外泌体细胞来源的蛋白具有相对特异性：如B 淋巴细胞分泌的外泌体表面有MHC-II 类分子；肿瘤细胞来源的外泌体携带大量肿瘤抗原[4]。此外，外泌体部分蛋白也可以用于疾病的早期诊断，如胎球蛋白A 可作为急性肾损伤的标志物[5]。再如乳腺癌的外泌体促凋亡蛋白生存素2B（Survivin2B），于乳腺癌早期患者中，表达较多，晚期弱表达甚至不表达，与肿瘤分级呈负相关[6]。因此，外泌体生存素2B 可作为乳腺癌早期诊断的肿瘤标志物。

1.2 外泌体所含脂质

外泌体富含脂质，外泌体膜与细胞膜较接近，富含鞘磷脂，胆固醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇等成分，同时也含有细胞来源的脂质。这些脂质成分，既能维持外泌体脂质双分子层的结构，促进膜的流动，保护外泌体的内容物miRNA，mRNA，蛋白质等成分的完整，膜上的脂质分子又能作为信号分子，介导细胞间通讯。

1.3 外泌体所含核酸

除蛋白，脂质外，外泌体含有大量的微小RNA（MicroRNA，miRNA） 和 信 使RNA（message RNA，mRNA），核糖体RNA（rRNA），线粒体DNA（mtDNA）等。一直以来，我们多是依靠肿瘤的大小、恶性程度、淋巴结是否转移、肿瘤分期与分级，来判断疾病及其预后。如今，外泌体携带的核酸可以作为疾病早期诊断的标志物，如食管癌细胞分泌的外泌体miR-21 可以辅助食管癌的诊断[7]，外泌体miR-145 可作为糖尿病肾病的早期诊断，再如胃癌来源的外泌体携带的长链非编码RNA(LncRNA)在进行肿瘤诊断上，比CEA，CA199 更有诊断价值。此外，外泌体携带的核酸，可以调节靶细胞基因的调控。如乳腺癌来源的外泌体通过分泌miR-10，下调内皮细胞紧密蛋白的表达，增加血管内皮的通透性，促进乳腺癌的血源性转移[8]。

2 外泌体之外的几种胞外囊泡

机体分泌的囊泡不仅有外泌体，还有微泡和凋亡小体。虽然这些小囊泡都是由细胞分泌的，内部均包含从母带细胞中获得的胞浆，但是它们之间也有差异。微泡和外泌体主要是由活细胞释放的，而凋亡小体主要是由凋亡细胞释放的。在实验中，由于微泡直径与外泌体较接近，故两者容易混淆。

2.1 微泡

一开始，Chargaff[9]认为微泡是无血小板血浆中的沉淀物质，能产生凝血酶。随后，进一步研究发现，微泡，主要是由血小板，红细胞，内皮细胞等胞膜出芽形成的[10]。它具有磷脂双分子层结构，直径是在100-1000 nm 之间，与病毒直径范围接近，但是在血浆中，可以观察到，微泡的直径在100-400纳米之间。微泡与外泌体较相似，可以与靶细胞膜直接融合，介导细胞间物质交换与子代与亲代之间信息沟通。有研究表明，红细胞释放微囊泡的数量容易受到环境因素的影响，故不能稳定释放。然而，肿瘤细胞不易受到环境因素影响，稳定释放微囊泡。由于微泡的数量，反映疾病与机体生理状态。目前，人们应用流式细胞术来检测微泡数量，尽管其具有局限性，不能检测直径小于200 nm 的囊泡，但它仍是检测微泡应用最广泛的技术。

2.2 凋亡小体

凋亡小体，主要是由凋亡细胞释放的，其直径为1 ～5 μm。它的特点是凋亡小体磷脂酰丝氨酸外化同时其内部可能含有碎片DNA。凋亡小体的主要功能是能够向靶细胞转移基因，从而可以促进吞噬细胞出现T 细胞表位，促进B 淋巴细胞表达细胞自身抗原等[11]。

3 外泌体与细胞间通讯方式

一直以来，我们认为，细胞之间的交流都是通过细胞间接触或者分子来实现的，如激素，如神经递质等。但是自从外泌体被发现以来，人们发现它也是细胞间信息传递的方式之一，它作为细胞间交流的媒介，参与细胞间物质传递与信息传递。外泌体可以直接或者间接与靶细胞接触，来进行信号传递的。外泌体与细胞信息交流可能通过以下几种：

3.1 外泌体或其释放的物质与细胞膜表面配体结合

这是由受体配体作用以及细胞表面的磷脂酰丝氨酸介导的。细胞分泌的外泌体表面的Wnt 蛋白与靶细胞表面受体结合，调节靶细胞的分化[12]。此外，一部分外泌体可以向细胞外释放一些因子，如白介素等，这些因子与靶细胞结合，介导一定的生物学功能。肿瘤细胞来源的外泌体可以在在酸性条件向胞外释放EGF、VEGF 等成分，这些成分作用到血管内皮细胞表面受体导致血管形成，肿瘤生长[13]。

3.2 外泌体被受体细胞内吞

这种方式也是极常见的一种作用方式。细胞吞入的物质为液体与极小的颗粒物质，这属于胞饮形式。受体细胞的内吞活动依赖于囊泡的大小，而囊泡的大小取决于囊泡所含有的内容物。大的囊泡，则需要通过受体细胞的胞吞进入细胞内。此过程是细胞骨架蛋白（微管蛋白，肌动蛋白）介导的。同时，该过程受到受体细胞吞噬能力的影响。外泌体内吞进入到细胞内，它便与靶细胞器膜融合，向细胞质释放携带的内容物作用于受体细胞，但是最终这些内容物会被受体细胞溶酶体降解。研究发现，受体细胞内吞外泌体，则可以通过网格蛋白依赖性内吞作用和网格蛋白非依赖性途径，这两条途径得以实现[14-15]。

3.3 外泌体与靶细胞膜融合

在体内微环境作用下，在Alix 和LBPA 的参与下，外泌体膜与细胞膜融合，外泌体内容物转移到受体细胞从而进行信号传导。陈纤[16]研究中，外泌体用红色FM4-64 荧光染色，H460 细胞用绿色DiO 荧光染色。在DM2000 倒置相差荧光显微镜下，观察到外泌体进入H460 内，并且H460 细胞膜部分显示橙色（橙色为红色与绿色的共定位）可判断，膜融合也是外泌体信息传递的一种方式。

4 外泌体的临床诊断价值

在各种疾病中，外泌体可以辅助临床用于疾病诊断。Bhagirath[17]等人在研究发现，外泌体miRNA-1246 可以将正常人群，前列腺增生患者，以及侵袭性前列腺癌患者鉴别来。另有研究人员在研究中发现，外泌体PSA，PSMA 蛋白，可以用于前列腺癌的诊断[18]。JIA[19]等人表明，外泌体miRNA-21可以辅助临床用于乳腺癌的诊断。因此，将外泌体用于临床指日可待。

5 展望

目前，外泌体的研究逐渐深入，人们对外泌体结构，几种细胞外囊泡的鉴别，以及外泌体如何与靶细胞如何进行通讯等有了较深入研究，但是更深层次的机制仍有待继续研究研讨。此外，外泌体内容物的发现包括脂质，核酸，蛋白，均有望应用于临床，为临床疾病诊断提供新的方向。