烟草赤星病生防芽孢杆菌的筛选鉴定及其生长条件研究

宋莉莎，司世飞，龙友华，，刘仁祥，李 忠，

(1.贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025； 2.贵州大学 贵州省烟草品质研究重点实验室，贵州 贵阳 550025)

烟草赤星病是一种发生于烟叶成熟中后期的重要病害，具有潜育期短、流行速度快的特点，可直接影响烟叶的品质和产量。赤星病的病原菌为链格孢菌(Alternariaalternata)，属半知菌亚门链格孢属[1]。目前，赤星病的防治方法包括选育抗病品种、化学药剂防治、生物防治、农业措施防治等多种。在众多防治方法中，生物防治对烟草生产的可持续性发展具有极大的意义，也是近年来科技工作者研究较多和最具发展潜力的一种防治方法，受到国内外的普遍关注。生物防治利用有益微生物对植物病原菌的不良影响，使病原菌致病性减弱、数量减少，从而达到病害防治的效果[2]，其不污染环境、不产生抗药性、对人无毒害[3]，符合人们对环境保护和农业可持续发展的要求。在病害的生物防治中，生防细菌及其代谢产物均发挥了十分重要的作用[4]。其中，生防芽孢杆菌(Bacillusspp.)不仅耐高温、紫外线、酸碱，具较强抗逆性，且具有杀菌高效、防治效果佳、安全性评价高、可诱导抗病性、促生增产、便于制剂化、成本较低等优点[5]，是科研和生产中应用较多的生防细菌[6]。基于此，根据菌株对烟草赤星病菌的抑菌效果，采用平板对峙培养法和双层平板打孔法从贵州省瓮安县植烟土壤中分离筛选生防芽孢杆菌，并对其进行分类鉴定，初步探讨生防菌的生长条件，为烟草赤星病的生物防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试病原菌

烟草赤星病菌WN1菌株，由贵州大学农学院植物病理学实验室分离、保存。

1.2 培养基

NA培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化钠5 g、琼脂15～20 g、蒸馏水1 000 mL。

NB培养液：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL。

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、蒸馏水1 000 mL。

PDB培养液：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL。

平板计数琼脂培养基：葡萄糖1 g、酵母提取物2.5 g、胰蛋白胨5 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL。

碳源基础培养基：酵母粉10 g、NaCl 1 g、K2HPO40.1 g、MgSO40.05 g、蒸馏水1 000 mL。

氮源基础培养基：葡萄糖10 g、NaCl 1 g、K2HPO40.1 g、MgSO40.05 g、蒸馏水1 000 mL。

上述培养基pH值均为7.0～7.2。

1.3 土壤细菌的分离、纯化、保藏

从贵州省瓮安县烟草种植基地植烟土壤中随机采集土样，带回实验室烘干备用。称取10 g土样于装有90 mL无菌水的锥形瓶中，在摇床中充分振荡20 min，采用稀释涂布平板法将稀释至10-6和10-72个浓度的菌液涂布于NA平板上，置于35 ℃下恒温培养3 d，对平板上形态特征有差异的细菌进行转接纯化，保存于NA试管斜面上。

1.4 拮抗细菌的筛选

初筛：采取平板对峙培养法筛选，以抑菌带的大小为标准，筛选出抑菌带较大的菌株。

复筛：采用双层平板打孔法，对初筛中抑菌带较大的菌株进行复筛，方法参照祝学海等[7]稍作改良。其中，测试菌发酵上清液的制备方法为：在100 mL NB培养液中接种测试菌的2～3个单菌落，置于33 ℃、120 r/min摇床中振荡培养12 h后，于12 000 r/min 离心2 min，取规格为0.22 μm的滤头分批次过滤上清液，留滤液备用。

1.5 拮抗细菌的分类鉴定

1.5.1 形态及生理生化鉴定 将筛选出的菌株进行菌落形态观察及生理生化测试，方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[8]、《芽孢杆菌属》[9]，其中生理生化测试指标包括：V-P测定、丙酸盐利用、厌氧生长、接触酶、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、甲基红、明胶液化、淀粉水解、氧化酶等。

1.5.2 分子鉴定 采用改良的CTAB法提取拮抗菌的DNA。首先根据细菌16S rDNA序列的特性及其保守序列扩增拮抗菌的16S rDNA，正向引物和反向引物分别为BSF(27F)和BSR(1492R)，采用1.0%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测[10]。进一步扩增gyrA基因，采用引物为gyrA-F和gyrA-R[11]。对基因扩增产物纯化后测序(上海生工生物工程技术有限公司)，将所测得的序列进行拼接并提交GenBank数据库中进行BLAST比对分析。采取MP法，用系统发育分析软件PAUP*4.0b10[12]构建系统发育进化树。

1.6 拮抗细菌生长条件测定

1.6.1 菌悬液的制备 在NA平板上活化生防菌，然后接种2环活化菌于100 mL NB培养液中，在35 ℃恒温下持续振荡(150 r/min) 36 h制作生防菌液。取生防菌液1 mL，通过浓度梯度稀释法配制10-5、10-6、10-7、10-84个浓度的菌液，用平板计数琼脂培养基平板培养24 h后统计平板上细菌菌落数(每个浓度3次重复)，计算母液浓度，并将母液浓度用无菌水稀释到108cfu/mL。

1.6.2 生长曲线的测定 取0.5 mL浓度为108cfu/mL的菌悬液接种到100 mL灭菌的NB培养液中，于35 ℃下恒温振荡(150 r/min)培养。接种后的前24 h，每隔2 h用分光光度计在625 nm波长下测其OD值，24 h后每隔12 h测一次。以接0.5 mL无菌水的NB培养液为对照，每个处理3次重复。

1.6.3 温度对拮抗细菌生长的影响 取0.1 mL浓度为108cfu/mL的菌液接种到50 mL(三角瓶250 mL)的灭菌NB培养液(pH值7.0)中，然后分别置于0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃的恒温摇床振荡 (150 r/min) 培养，48 h后用分光光度计在波长625 nm下测其OD值。以不接菌的培养液为对照，每个温度3次重复。

1.6.4 pH值对拮抗细菌生长的影响 将灭菌后的NB培养液按每瓶30 mL装于三角瓶(100 mL)中，将pH值分别调为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。然后接种0.1 mL浓度为108cfu/mL的菌液于不同pH值的NB培养液中，35 ℃恒温振荡(150 r/min)培养，48 h后用分光光度计在波长625 nm下测其OD值。以不接菌的培养液为对照，每个处理3次重复。

1.6.5 碳源对拮抗细菌生长的影响 碳源种类为甘露醇、麦芽糖、木糖醇、葡萄糖和可溶性淀粉等，以1%的量分别加到碳源基础培养基(20 mL)中并灭菌。取10 μL浓度为108cfu/mL的菌液于各处理培养基内，35 ℃下振荡(150 r/min)培养，以不接菌的培养基为对照，48 h后观察并在625 nm处测定菌体的OD值。

1.6.6 氮源对拮抗细菌生长的影响 氮源种类为蛋白胨、草酸铵、牛肉膏、酵母浸膏和尿素等，以1%的量分别加到氮源基础培养基(20 mL)中并灭菌。取10 μL浓度为108cfu/mL的菌液于各处理培养基内，35℃下振荡(150 r/min)培养，以不接菌的培养基为对照，48 h后观察并在625 nm处测定菌体的OD值。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的筛选

采用平板对峙培养法初步筛出8株可抑制烟草赤星病菌生长的菌株，再用双层平板打孔法进行复筛，从中筛选出4株可明显抑制烟草赤星病菌生长的菌株，其中抑菌活性最强的菌株为F11，其无菌发酵上清液对病菌生长的抑菌带可达23.5 mm(图1)。

A、B.平板对峙培养法(A.病原菌对照；B.F11菌株+病原菌)；C.双层平板打孔法 A，B.Plate duel culture method(A.pathogen；B.F11+pathogen)；C.Double plate punching method图1 生防菌F11对烟草赤星病菌的拮抗作用Fig.1 The inhibitory effects of the biocontrol strain F11 on A.alternata

2.2 拮抗细菌的鉴定

2.2.1 形态鉴定 菌株F11在NA培养基上生长的单个菌落较小，近圆形，中心突起，稍透明，白色，菌落边缘较整齐。光学显微镜下观察，菌体呈短杆状，为革兰氏阳性菌，可产生椭圆形的芽孢(图2)。

2.2.2 生理生化鉴定 如表1所示，菌株F11为需氧菌，V-P测定、淀粉水解、明胶液化、硝酸盐还原、接触酶、甲基红、柠檬酸盐利用等生理生化试验呈阳性，丙酸盐利用、氧化酶反应呈阴性，菌株可在2%、4%的NaCl培养液中生长，不可在6%、9%的NaCl培养液中生长。结合形态学和生理生化特征，初步鉴定菌株F11为芽孢杆菌属细菌。

图2 生防菌F11菌落形态特征(A)、革兰氏染色(B)及芽孢染色(C)Fig.2 The colony morphology characteristics(A),Gram stain(B) and spore stain(C)of the biocontrol strain F11表1 生防菌F11的生理生化特性测定结果Tab.1 The physiological and biochemical determination results of the biocontrol strain F11

序号Number项目Items 特征Characteristics1V-P+2丙酸盐利用 -3淀粉水解 +4硝酸盐还原 +5厌氧生长-6接触酶+7柠檬酸盐利用 +8甲基红 +9明胶液化+10氧化酶 -112% NaCl+124% NaCl+136% NaCl-149% NaCl-

注：+.阳性反应；-.阴性反应。

Note: +.Positive reaction;-.Negative reaction.

2.2.3 16S rDNA及gyrA基因序列分析 扩增F11菌株的16S rDNA序列，测序后在NCBI中用BLAST程序比对，结果表明，F11的16S rDNA序列与芽孢杆菌属有99%的同源性。进一步测定F11菌株的gyrA基因序列，并与GenBank数据库的序列进行同源性比对，结果发现，F11的gyrA基因序列与甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)Y37菌株的同源性达99%。将16S rDNA和gyrA基因序列拼接，采取MP法，用系统发育分析软件PAUP*4.0b10构建联合基因系统发育树，结果如图3所示，F11菌株与甲基营养型芽孢杆菌Y37分支距离最近。将F11菌株的16S rDNA和gyrA基因序列提交GenBank数据库，登录号分别是KY992872、MK120110。

结合菌株培养特征、生理生化特性及16S rDNA与gyrA联合基因系统发育分析，将菌株F11鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。

图3 生防菌F11基于16S rDNA与 gyrA基因序列的系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree of the biocontrol strain F11 based on 16S rDNA and gyrA gene sequences

2.3 拮抗细菌的生长条件测定

2.3.1 培养时间对细菌生长的影响 如图4所示，F11菌株接种到NB培养液10 h后进入对数生长期，14～16 h为对数期末期，18 h后处于稳定生长期，菌体数量趋于稳定。可见，该菌生长速度较快，接种18 h后菌体吸光值达到最大。

2.3.2 温度对细菌生长的影响 如图5所示，温度对F11菌株的生长影响较大，当温度在5～35 ℃，F11菌量随着温度的升高而增加，以35 ℃为最适生长温度。随着温度继续升高，菌量急剧下降，50 ℃几乎停止生长。

2.3.3 pH值对细菌生长的影响 如图6所示，pH值对F11菌株生长有明显的影响，pH值3.5～10.0内菌株均能生长，其中pH值为3.5～6.0时，菌量随着pH值升高而增加。菌株生长较适宜的pH值范围为4.5～8.0，最适pH值为6.0。

图4 菌株F11的生长曲线Fig.4 The growth curve of F11 strain

图5 温度对F11菌株生长的影响Fig.5 The effect of temperature on the growth of F11 strain

图6 pH值对F11菌株生长的影响Fig.6 The effect of pH value on the growth of F11 strain

2.3.4 碳源、氮源对细菌生长的影响 如图7所示，F11菌株对葡萄糖、木糖醇、甘露醇、可溶性淀粉和麦芽糖均能利用，其中以葡萄糖的利用率最高，菌液吸光值为0.803，其次是麦芽糖。

如图8所示，F11菌株能够利用蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、草酸铵和尿素作为生长氮源，其中蛋白胨的利用率最高，其次是草酸铵和酵母浸膏。

不同字母表示在0.05水平下差异显著，下同 Different letters indicate significant difference at 0.05 level,the same below图7 碳源对F11菌株生长的影响Fig.7 The effect of carbon source on the growth of F11 strain

图8 氮源对F11菌株生长的影响Fig.8 The effect of nitrogen source on the growth of F11 strain

3 结论与讨论

拮抗细菌在植物病害的生物防治中扮演着非常重要的角色。与其他生防细菌相比，芽孢杆菌除了具有出色的生防潜力，还可产生耐热抗逆的芽孢，有利于生防菌剂的生产、剂型加工和菌种在环境中存活、定殖及繁殖，是植物病害生防微生物的重要组成部分[13-15]。

本试验从植烟土壤中分离筛选的F11菌株，对烟草赤星病菌具有较强的抑菌作用。通过菌株形态观察及生理生化测试，结合16S rDNA及gyrA基因序列比对，将该菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。目前有关甲基营养型芽孢杆菌的研究报道不多。甲基营养型芽孢杆菌是MADHAIYAN等[16]2010年报道的新种。研究表明，该类菌株对香蕉枯萎病菌、烟草黑胫病菌、水稻稻瘟病菌、番茄枯萎病菌等均具有较强的抑菌活性[17-21]。胡江春等[22]研究发现，甲基营养型芽孢杆菌9912经培养后产生的物质对植物真菌类病害病原菌具有较强的抑菌作用，同时其也可作为植物根际促生菌(PGPR)促进植物生长，有望成为新型的生物杀菌剂。对F11菌株生长条件的研究表明，该菌株生长速度较快，在接种18 h以后进入稳定期，适应的温度和pH值范围较广，生长的最适温度是35 ℃，最适pH值为6.0，并可以利用多种碳源和氮源进行生长。菌株生长的适宜条件与贵州烟区烟草赤星病发病环境条件相近，因此，菌株F11具有应用于烟草赤星病生物防治的潜力。

目前对甲基营养型芽孢杆菌作为生防菌的研究报道较少，还未见该类菌在烟草赤星病防治方面的研究报道。本试验仅对F11菌株的分类地位及基本的培养条件进行了研究，有关其作用机制及田间应用等，有待进一步研究与探讨。