木醋液对玉米大斑病菌的抑制作用

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(唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000)

木醋液是利用树木残枝枯叶、木屑，经热解炭化、冷凝回收分离而制成的液体[1]。研究发现，木醋液除了在促进植物生长及畜牧业、林业等方面有应用之外，还对细菌、真菌有抑制作用，并且具有广谱杀菌活性[2]。尉芹等[3]发现，核桃壳木醋液对大肠杆菌、变形杆菌等细菌和黑曲霉、青霉等霉菌具有抑制作用。毛巧芝等[4]发现，苦杏壳木醋液对产气杆菌、大肠杆菌等细菌和黄瓜炭疽病菌、棉花黄萎病菌、辣椒疫霉病菌等植物病原菌均具有一定的抑制作用，但抑制机制尚不清楚。

玉米大斑病是玉米生产上的重要病害之一，暴发时会造成严重的经济损失[5]。目前防治玉米大斑病的方法主要是抗病育种和化学防治。抗病育种耗时、费力，且抗病品种具有一定使用期限[6]，而利用农药进行化学防治还会有残留、环境污染等问题。利用木醋液抑菌作用进行病害防治，不仅成本低廉，而且无残留、无污染。为此，研究木醋液对玉米大斑病菌的抑制作用，分析其抑制机制，为玉米大斑病的生物防治奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

木醋液原液由唐山新雅诺生物科技有限公司生产，密度为1.009 8 g/mL。

玉米大斑病菌11-07D菌株，由唐山师范学院分子植物病理实验室保存。

1.2 木醋液对玉米大斑病菌菌丝生长的影响试验

配制木醋液含量分别为0(对照)、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的PDA平板培养基，其中木醋液的质量浓度分别为0.00、5.05、10.10、15.15、20.20、25.25 mg/mL，接种在PDA平板培养基中已活化6～7 d的玉米大斑病菌11-07D菌株的菌盘(直径8.0 mm)。每个处理4个PDA平板，试验重复3次。28 ℃恒温培养，待第7天对照组菌丝长至平板约2/3处时，采用十字交叉法测量菌落直径，参照史冠昭等[7]的方法计算抑制率，抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌盘直径)×100%。

1.3 木醋液对玉米大斑病菌菌丝形态的影响试验

配制木醋液质量浓度分别为0.00(对照)、5.05、10.10、15.15、20.20、25.25 mg/mL的PDA平板培养基并接种玉米大斑病菌，待对照菌丝长满平板后，按十字交叉法取各试验处理的菌落内4个部位的菌丝，在显微镜下观察菌丝分枝数目、细胞壁颜色深浅、内含物以及细胞大小等菌丝形态的变化。每个处理重复3次。

1.4 木醋液对玉米大斑病菌生物量的影响试验

配制木醋液质量浓度分别为0.00(对照)、5.05、10.10、15.15、20.20、25.25 mg/mL的PD液体培养基100 mL，接种3个直径为8.0 mm的菌盘，180 r/min、28 ℃振荡培养4 d，过滤去除培养基，压干菌丝后测定菌丝生物量。每个处理重复3次，计算抑制率，抑制率=(对照菌丝生物量-处理菌丝生物量)/对照菌丝生物量×100%。

1.5 木醋液对玉米大斑病菌产孢量的影响试验

配制木醋液质量浓度分别为0.00(对照)、5.05、10.10、15.15、20.20 mg/mL的PDA平板培养基并接种玉米大斑病菌，待菌丝长满平板后，滴加10 mL灭菌水，用毛笔快速刷菌丝，将孢子洗下，用2层纱布过滤，制成孢子悬浮液，用血细胞计数板测量分生孢子的数量[8]。每个处理重复3次。

1.6 木醋液对玉米大斑病菌分生孢子萌发的影响试验

配制浓度为1.6×105个/mL的11-07D菌株分生孢子悬浮液，离心，去上清，加入200 μL质量浓度分别为5.05、10.10、15.15、20.20、25.25 mg/mL 的木醋液，以加入无菌水为空白对照，每个处理重复3次。处理12 h后采用悬滴法观测分生孢子萌发率[9]，计算分生孢子萌发抑制率，抑制率=(对照分生孢子萌发率-处理分生孢子萌发率)/对照分生孢子萌发率×100%。

1.7 数据统计

利用SPSS.18软件(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)进行试验数据的方差分析，利用GraphPad Prism软件作图。

2 结果与分析

2.1 木醋液对玉米大斑病菌菌丝生长的影响

测定不同浓度木醋液对玉米大斑病菌菌落生长的抑制作用，结果发现，随着木醋液质量浓度增大，菌丝生长速度明显变慢(图1)。当木醋液质量浓度为5.05 mg/mL时，菌丝生长已受到显著抑制(P<0.05)(图2)，当木醋液质量浓度达到25.25 mg/mL时，抑制率可达100%，菌丝表现为无生长。

2.2 木醋液对玉米大斑病菌菌丝形态的影响

在正常生长情况下，菌株11-07D菌丝为规则条状，细胞呈长圆柱状。在接种后第9天观察菌丝形态发现，木醋液质量浓度为5.05、10.10 mg/mL处理组与对照组菌丝无明显差别，质量浓度高于15.15 mg/mL时菌丝分枝数逐渐增加，质量浓度为20.20 mg/mL时，部分菌丝内含物出现空洞。在接种后第18 天观察菌丝形态，5.05 mg/mL木醋液处理组与对照组的菌丝形态没有明显差别，随着木醋液质量浓度的增加，菌丝细胞的内容物逐渐减少，空洞增多，少数菌丝出现畸形，细胞壁颜色加深，但菌丝细胞大小无明显差异(图3)。

A—F：木醋液质量浓度分别为0.00、5.05、10.10、15.15、20.20、25.25 mg/mL A—F: The mass concentration of wood vinegar was 0.00, 5.05, 10.10, 15.15, 20.20 and 25.25 mg/mL, respectively图1 木醋液对玉米大斑病菌菌丝生长的影响Fig.1 The effects of wood vinegar on the hypha growth of Setosphaeria turcica

相同小写字母表示在0.05水平下差异不显著，不同小写字母 表示在0.05水平下差异显著，下同

The same lowercase letters in the figure indicate no significant difference at 0.05 level, and Different lowercase letters represent significant differences at 0.05 level. The same below

图2木醋液对玉米大斑病菌菌落直径的影响
Fig.2TheeffectsofwoodvinegaronthecolonydiameterofSetosphaeriaturcica

A—E：木醋液质量浓度分别为0.00、5.05、10.10、15.15、 20.20 mg/mL A—E: The mass concentration of wood vinegar was 0.00, 5.05, 10.10, 15.15,20.20 mg/mL,respectively图3 木醋液对玉米大斑病菌菌丝形态的影响Fig.3 The effects of wood vinegar on the hypha morphology of Setosphaeria turcica

2.3 木醋液对玉米大斑病菌液体培养生物量的影响

利用液体振荡培养，接种后第4天测定生物量，结果发现，5.05 mg/mL木醋液处理对玉米大斑病菌液体培养生物量的抑制率为12.81%，当木醋液质量浓度增加到10.10 mg/mL时对生物量的抑制率迅速增加到68.34%，两者之间差异达到显著水平(P<0.05)(图4)。而当PDA平板中木醋液质量浓度为10.10 mg/mL时，对菌丝生长抑制率仅为38.27%，与液体生物量抑制率相比减少了30.07个百分点，表明液体培养时病菌菌丝生长对木醋液质量浓度更敏感。当木醋液质量浓度超过15.15 mg/mL时，其对液体培养生物量的抑制率达93%以上，表现为几乎无菌丝生长。

图4 木醋液对玉米大斑病菌生物量的抑制作用Fig.4 The inhibition of wood vinegar on the hypha biomass of Setosphaeria turcica

2.4 木醋液对玉米大斑病菌分生孢子数量的影响

当对照组和处理组菌丝长满平板后，分析不同质量浓度木醋液对玉米大斑病菌分生孢子数量的影响。结果发现，处理组与对照组的孢子数量没有显著差别(P<0.05)(图5)，说明木醋液不影响玉米大斑病菌分生孢子数量。

图5 木醋液对玉米大斑病菌分生孢子数量的影响Fig.5 The effects of wood vinegar on the conidial quantity of Setosphaeria turcica

2.5 木醋液对玉米大斑病菌分生孢子萌发的影响

在木醋液处理12 h后，测定分生孢子的萌发率，结果发现，5.05 mg/mL木醋液处理后分生孢子萌发率由对照组的66.0%下降到43.7%，两者之间差异显著(P<0.05)(图6)。木醋液质量浓度超过10.10 mg/mL后，分生孢子的萌发率迅速下降，木醋液质量浓度为25.25 mg/mL时对分生孢子萌发的抑制率达90.4%。因此，木醋液对玉米大斑病菌孢子萌发具有明显抑制作用。

图6 木醋液对玉米大斑病菌孢子萌发的影响Fig.6 The effects of wood vinegar on the conidial germination of Setosphaeria turcica

3 结论与讨论

木醋液是干馏热解农林废弃物时产生的气体，经冷凝分离后得到的红褐色液体，含有酸类、酚类、醛类、酮类、醇类和酯类等200多种成分，是一种天然无公害的农业生产资料[1]，不仅可以作为土壤改良剂用于降低土壤含盐量[10-11]，还具有促进植物生长的作用[12]，能够同时提高农作物的产量和品质[13-14]。木醋液对细菌和真菌都有一定的抑制作用，其中起抑制作用的主要成分是酸类和酚类化合物[15-16]。有关木醋液对植物病原真菌抑制作用的研究较少，李燕等[17]发现0.8%的木醋液能够抑制禾谷镰刀菌菌丝生长，马骏等[18]发现马铃薯晚疫病菌在3%的木醋液黑麦培养基中停止生长，薛桂新等[19]发现100 mg/mL木醋液处理可完全抑制桃黑根霉的菌丝生长。以上研究仅分析了木醋液对菌丝生长的抑制作用，没有探讨其对菌丝形态和分生孢子萌发的影响。本试验发现，5.05 mg/mL(0.5%)木醋液处理时，玉米大斑病菌的菌丝生长和分生孢子萌发已受到显著抑制；15.15 mg/mL(1.5%)以上木醋液处理菌丝细胞形态发生显著变化，内含物减少，空洞增加，液体培养的菌丝生物量下降93%以上；25.25 mg/mL(2.5%)木醋液处理后，玉米大斑病菌完全停止生长，分生孢子萌发抑制率达90.4%。鉴于木醋液对根结线虫和辣椒病毒病都有较好的防治效果[20-21]，把木醋液开发成为一种天然抑菌剂用于防治玉米大斑病，也将具有非常广阔的应用前景。