忧遁草茎段悬浮培养快繁体系的建立

，兴斌，

(大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034)

忧遁草(Clinacanthusnutans)，又称鳄嘴花、沙巴蛇草等，为爵床科鳄嘴花属植物[1]，广泛分布在马来西亚、印度尼西亚以及我国海南、广东等地，主要生长环境以低海拔亚热带疏林或灌丛为主。近年来，由于忧遁草在抗肿瘤方面的医疗价值，以及被列入新资源食品原料目录的原因，人们对忧遁草的需求急剧增加，仅靠野生资源很难满足药食两用的市场供应[2-5]。

目前，市场上的忧遁草供应以野生资源为主，大田栽培为辅。大田栽培方式存在着与农业争地、重毒副残留、季节和气候限制以及劳动量大等突出问题。因此，利用植物组织培养技术，规模化生产忧遁草种苗作为野生或栽培忧遁草的补充和替代品具有一定的意义。但是，传统植物组织培养方式存在着成本高、劳动量大等瓶颈因素，因此，发展新型植物组培技术、降低组培苗的生产成本，将大大促进包括忧遁草在内的植物组培技术的商业化[6]。液体培养方式具有增殖系数高、劳动量小、有利于自动化控制等优点，可以短时间培养大量的组培苗用以满足市场的需求[7]。鉴于此，初步优化了忧遁草茎段液体培养的条件，在无菌苗固体培养技术的基础上，建立无菌苗液体高效繁殖体系，为基于生物反应器的忧遁草无菌苗规模化培养提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 植物材料

大连工业大学珍稀濒危药用植物细胞工程实验室以马来西亚忧遁草为材料，制备出无菌苗并继代保存，作为本研究的试验材料。

选取生长健壮的马来西亚忧遁草实生苗茎段，去除叶片，切成5～6 cm长的茎段，每段保留多个节点，经75%乙醇处理30 s、无菌水冲洗2次、10%次氯酸钠浸泡、无菌水冲洗2次、0.1%氯化亚汞(添加5～6滴吐温-20)10 min、无菌水清洗4次后，将茎段用无菌滤纸吸干表面水分，然后将茎段切成1～2 cm的茎段，每段需有1个节点，用镊子将茎段接种于培养基中，每瓶接入3个茎段，在25 ℃和光照强度1 500 lx(12 h/d)下培养30 d，得到忧遁草无菌苗，作为后续建立液体培养的试验材料。

1.2 方法

1.2.1 植物生长调节剂的筛选 采用L9(34)正交表设计正交试验，以IBA、6-BA、NAA和KT作为4个因素，每个因素设置3个水平(表1)，不考虑各因素之间的交互作用。将1～2 cm带芽的无菌茎段，分别接种到含有不同植物生长调节剂组合的液体培养基中(MS+蔗糖30 g/L，pH值6.0)，每组试验20瓶，重复3次。将接种后的培养基置于25 ℃和1 500 lx(12 h/d)的培养室中培养30 d，观察忧遁草芽发生及生长状态，测定无菌苗茎高和根长，统计根数。

1.2.2 培养基类型的筛选 采用单因素试验法设计试验。选取1～2 cm带芽的无菌茎段，分别接种到MS、1/2MS、B5、1/2B5和N6等5种液体培养基(IBA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L，pH值6.0)中，其余步骤及参数分析同1.2.1。

表1 液体培养基中植物生长调节剂及其质量浓度配比设置Tab.1 Experimental design of plant growth regulator and mass concontration combination in liquid medium

1.2.3 培养基中蔗糖质量浓度的筛选 采用单因素试验法设计试验。选取1～2 cm长的带芽无菌茎段，分别接种到含有0、10、20、30、40、50 g/L蔗糖的1/2MS液体培养基(IBA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L，pH值6.0)中，其余步骤及参数分析同1.2.1。

表2 液体培养基中值设置Tab.2 Experimental design of ratio in liquid medium

1.2.5 培养基中磷源浓度的筛选 采用单因素试验法设计试验。选取1～2 cm长的带芽无菌茎段，分别接种到含有0、0.2、0.625、1.5、3、5 mmol/L磷酸根离子的1/2MS液体培养基(IBA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L，pH值6.0)中，其余步骤及参数分析同1.2.1。

2 结果与分析

2.1 植物生长调节剂及其质量浓度对液体培养下忧遁草茎段悬浮生长的影响

如表3所示，6-BA能够促进腋芽增殖，IBA和NAA共同作用诱导根的生成；同时，NAA也有促进忧遁草生长的作用。以茎高作为评价指标，极差分析结果表明，组合7培养基中忧遁草的茎高最大，达到11.37 cm，即最优组合为IBA 1.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L；以忧遁草生根数作为评价指标，组合9的根数最多，为3.55个，即最优组合为IBA 1.5 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L；以根的长度作为评价指标，组合6中忧遁草的根长最长，达5.98 cm，即最优组合为IBA 1.0 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.2 mg/L。本试验以忧遁草茎高为主要指标，最终确定忧遁草液体培养的最优组合为IBA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L。

表3 植物生长调节剂及其质量浓度对液体培养下忧遁草茎段悬浮生长的影响Tab.3 Effects of plant growth regulators and its mass concentration on suspension growth of Clinacanthus nutans segments in liquid culture

2.2 培养基类型对液体培养下忧遁草茎段悬浮生长的影响

从图1可以看出，1/2MS液体培养基表现最优，其茎高为11.83 cm，根数为3.59 个，根长为5.73 cm，叶片展开充分,叶色翠绿,茎粗壮,根系发达,根毛茂密；其次是1/2B5培养基，但叶片有枯黄脱落现象；MS和B5培养基中，根系较少、短而粗，但植株表现健壮；N6培养基中的忧遁草生长状态最差，植株低矮，叶片短、窄小，根部褐化严重。

2.3 蔗糖质量浓度对液体培养下忧遁草茎段悬浮生长的影响

由图2可知，当蔗糖质量浓度为20 g/L时，茎高最大，为11.83 cm，其植株叶片生长充分、叶色翠绿，根茎粗壮；随着质量浓度继续增大，蔗糖反而抑制植株的生长，表现为忧遁草植株开始变得矮小，部分产生褐化现象；与植株茎生长表现相反，当质量浓度达到40 g/L时，蔗糖植株的生根数及根长均达到最大，生根数为4.28个，根长为5.23 cm；但如果蔗糖质量浓度再升高，3种指标反而下降。总之，随着质量浓度的增大，蔗糖对忧遁草的生长呈现先促进后抑制的趋势。由此可以发现，在液体培养条件下，忧遁草茎段的生长，首先以根的生长发育为主，其次是茎叶的生长，由于高质量浓度(40 g/L)的蔗糖促进了根的生长，相对于茎叶的发育存在一定的抑制作用；当质量浓度过高(50 g/L)时，蔗糖对忧遁草的整体发育都存在抑制作用。综合考虑，液体培养过程中，忧遁草生长的最佳蔗糖质量浓度为20 g/L。

图1 培养基类型对液体培养下忧遁草茎段悬浮生长的影响Fig.1 Effect of liquid medium type on suspension growth of Clinacanthus nutans segments in liquid culture

图2 蔗糖质量浓度对液体培养下忧遁草茎段悬浮生长的影响Fig.2 Effect of sucrose mass concentration on suspension growth of Clinacanthus nutans segments in liquid culture

图值对液体培养下忧遁草茎段悬浮生长的影响Fig.3 Effects of ratio on the suspension growth of Clinacanthus nutans segments in liquid culture

2.5 磷源对液体培养下忧遁草茎段悬浮生长的影响

由图4可知，随着磷酸根离子浓度的增大，液体条件下忧遁草各指标的生长呈现先扬后抑的现象。当磷酸根离子浓度为1.5 mmol/L时，茎高为11.63 cm，根数为4.96 个，根长为5.27 cm。该处理植株的叶片展开充分，叶色翠绿，茎粗壮，根部发达，主根粗壮，根毛较多，为最佳处理。

图浓度对液体培养下忧遁草茎段悬浮生长的影响Fig.4 Effect of concentration on suspension growth of Clinacanthus nutans segments in liquid culture

3 结论与讨论

本研究结果表明，培养基类型、蔗糖浓度、氮元素形态、磷元素等参数影响液体培养条件下忧遁草的生长，通过优化这些参数可以改善忧遁草的生长状态。最佳培养条件为：改良的1/2MS培养基(20 mmol/L KNO3+5 mmol/L NH4NO3+1.5 mmol/L KH2PO4)+IBA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L，pH值6.0，其生根数为4.09 个，根长为5.47 cm，茎高为11.79 cm。

利用悬浮培养方式进行植株无菌苗的繁殖，具有操作环节少、劳动量低、单位时间和空间内繁殖系数高等优点。通过茎段繁育的无菌苗比体细胞胚分化的无菌苗健壮、成苗率高。在本研究中，采用改良的液体1/2MS培养基和优化的植物生长调节剂配比培养的忧遁草无菌植株健壮，叶色深绿，叶片展开充分。与忧遁草的传统固体培养相比，培养基中不需要加入琼脂，接种简便，不仅节省成本，而且繁殖系数高于固体培养。在忧遁草悬浮培养过程中，可以随时续加培养基和调整植物生长调节剂配比，保证忧遁草无菌苗始终处于旺盛的生长状态。另外，以悬浮培养方式获得的忧遁草无菌苗，不但可以为农业生产提供种苗，还可以直接食用或者入药，而且无“重毒副”残留。