基于蓄冷剂模拟贮运的秀珍菇细胞膜损伤和酶活力变化

王 蕾，俞凌峰，李君豪，严嘉玮，罗自生，李 莉*

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058）

随着社会经济增长，消费者对于果蔬的品质有了更高的要求。低温环境对采后贮藏和运输过程中果蔬品质特征维持具有重要作用[1-3]，目前我国果蔬低温贮运多采用冷链运输方式，费用相对较高。作为冷源，蓄冷剂利用相变蓄冷原理控制低温，可根据冷链运输的不同温度需求将不同蓄冷材料进行合理配置，达到食品冷链物流的要求，且因其低廉的成本和简易的操作，在食品低温贮藏、低温运输、低温加工、低温销售等食品冷链的各环节中都具有广泛的应用背景和巨大的节能潜力。目前，蓄冷剂在莴笋尖[4]、平菇[5]、韭黄[6]等多种蔬菜中的保鲜效果已有研究。

秀珍菇（Pleurotus geesteranus），又称姬平菇、小平菇等，隶属于担子菌门、伞菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属[7]，富含蛋白质、维生素和微量元素等且脂肪含量较低[8]，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节活性等生理活性功能[9-10]，深受消费者青睐。但其组织细嫩、没有外衣保护且存在自身自溶作用，严重影响了其食用品质和商品价值，是限制贮运保鲜的关键因素之一[11]。目前针对食用菌的保鲜技术研究主要包括低温保鲜[12-14]、保鲜剂保鲜[12]和气调保鲜[15-17]等。其中低温保鲜主要集中于研究不同贮藏温度对秀珍菇采后品质的影响，而有关蓄冷剂对秀珍菇贮藏运输中的作用研究较少。

本研究采用本实验室前期研发的蓄冷剂，对秀珍菇的冷藏效果进行了模拟贮藏和模拟运输实验。以常温贮藏为空白组，根据蓄冷剂与秀珍菇质量比分为1∶4组、1∶2组以及1∶1组，模拟贮藏即将秀珍菇置于常温（24±2）℃下贮藏，模拟运输即置于汽车的后备箱，每日行驶约120 km，气温在2～25 ℃范围内波动。每日测定秀珍菇细胞膜透性及酶活力等相关生理指标，从而研究蓄冷剂在模拟贮藏和模拟运输过程中对秀珍菇品质的影响，为进一步开发蓄冷剂在食用菌的冷链运输作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

秀珍菇（Pleurotus geesteranus）产自嘉兴市平湖市，采收于2017年12月至2018年2月，采收菌盖直径达3～4 cm、菌盖边缘内卷的秀珍菇，采收后2 h内运回实验室进行下一步处理。秀珍菇的模拟贮运实验每组用量为4 kg，生物性重复3 次。

蓄冷剂为本实验室前期所研制，主要配方为：甘氨酸0.4～0.8 mol/L、丙三醇0.1 mol/L、苯甲酸钠质量分数0.1%、高吸水树脂质量分数0.75%～0.81%。其相变潜热为296.4～305.9 J/g，Onset温度为－7.3～－5 ℃。

过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒 北京索莱宝公司。

1.2 仪器与设备

TGL-16M型离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；UV-5800PC型紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；CR-400型色差仪 柯尼卡美能达（中国）投资有限公司；MULTISKAN MK3型酶标仪 上海赛默飞世尔仪器有限公司；RC-4迷你型温度记录仪 江苏精创电器股份有限公司；LEICA EM UC7型超薄切片机北京海德创业生物科技有限公司；H-7650型透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM） 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 保温箱的制备及蓄冷剂的安置

在外径为500 mm×350 mm×320 mm、内径为450×300×270 mm的泡沫箱内的四壁中加入4 块已裁剪好且尺寸合适的4 个泡沫板（两块400 mm×240 mm×25 mm、两块300 mm×240 mm×25 mm），留出一定的高度，放置一块面积略小于泡沫箱底板面积的塑料孔板，然后将冻好的蓄冷板放在孔板上，其目的是较好地安置蓄冷剂，且可避免蓄冷剂与秀珍菇的直接接触，效果如图1所示。

图1 蓄冷剂安置的效果图（A）和实体图（B）Fig.1 Schematic （A） and photograph （B） of coolant installation in foam box

1.3.2 秀珍菇的模拟贮藏与运输方式

将秀珍菇随机分为4 组，根据蓄冷剂与秀珍菇质量比分别为CT（对照）组、1∶4组、1∶2组以及1∶1组，每组放置4 kg秀珍菇，孔板上分别安置0、1、2、4 kg的蓄冷剂。根据模拟贮运方式分2 批进行实验，分别为秀珍菇模拟贮藏和秀珍菇模拟运输。模拟贮藏实验中将包含秀珍菇和蓄冷剂的保温箱置于常温（（24±2）℃）下贮藏。模拟运输实验中将保温箱置于汽车的后备箱，以40 km/h每日行驶约120 km，外界气温在2～25 ℃范围内波动。实验过程中，采用RC-4迷你型温度记录仪实时监测箱体内温度。每种实验进行3 次生物性重复。1.3.3 秀珍菇保鲜品质指标的测定

1.3.3.1 外在表征及物理性质的测定

每批实验中每个处理随机称取秀珍菇样品100 g左右，每日进行拍照和称质量。使用差重法计算秀珍菇样品的质量损失率[18]，每组样品共重复测定15 次。用色差仪测定秀珍菇伞盖中部色度[19]，记录L*、a*、b*值，尽量避开明显的机械损伤，每组样品共重复测定15 次。

1.3.3.2 细胞膜透性相关指标的测定

参考曹建康等[20]的方法测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、细胞膜透性和H2O2含量。

1.3.3.3 TEM观察

TEM观察参考徐柏森等[21]的方法，并略作修改。取秀珍菇伞盖中部上表皮为样品，浸入体积分数2.5%的戊二醛中，固定2 h以上。用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液漂洗样品3 次，每次15 min，用体积分数1%的锇酸溶液固定样品2 h，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液漂洗样品3 次，每次15 min，乙醇梯度脱水，纯丙酮脱水2 次，Spurr包埋剂梯度渗透，70 ℃加热过夜。包埋块在超薄切片机中切片，获得70～90 nm的切片，切片经柠檬酸铅溶液、醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色5～10 min后观察。

1.3.3.4 SOD、CAT活力的测定

SOD、CAT活力的测定分别参考SOD试剂盒和CAT试剂盒说明书。

1.4 数据统计与分析

实验中指标的每个测量点都来自3 个生物性重复和至少3 个技术性重复，采用Excel软件进行数据统计和分析，采用Origin 8.0软件作图，采用DPS 7.05软件对所有数据在0.05水平上使用Duncan法分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 蓄冷剂处理对秀珍菇模拟贮运过程中温度的影响

温度是维持食用菌品质的最重要因素之一[22]。如图2A所示，在模拟贮藏实验前1 800 min，与对照组相比，蓄冷剂贮藏组温度明显更低。随贮藏时间延长，蓄冷剂贮藏组温度逐渐上升，而后趋于稳定，以其温度达对照组温度时记为失效。其中，1∶4组的蓄冷剂在1 875 min（1.3 d）失效，1∶2和1∶1组的蓄冷剂分别在2 618（1.8 d）、2 989 min（2.1 d）失效。如图2B所示，在模拟运输实验中，由于实验时间在冬季，保温箱放置于室外车辆后备箱中，运输温度随每日气温变化在2～25 ℃范围内有较大波动，随贮藏时间延长，蓄冷剂逐渐失效，贮藏后期蓄冷剂组箱内温度变化趋势与CT组相同。其中，1∶4组的蓄冷剂在1 785 min（1.2 d）左右失效，1∶2组和1∶1组的蓄冷剂在4 665（3.2 d）、4 890 min（3.4 d）左右失效。由此可知，蓄冷剂保持低温的效果随蓄冷剂用量增加而增强。

图2 秀珍菇模拟贮藏（A）和模拟运输（B）过程中箱内温度变化Fig.2 Change in temperature inside foam box during simulated storage （A） and transportation （B）

2.2 蓄冷剂处理对秀珍菇模拟贮运过程中外观特性的影响

图3 秀珍菇模拟贮藏过程中表观照片Fig.3 Photographs of Pleurotus geesteranus during simulated storage

如图3所示，模拟贮藏实验中，第0天秀珍菇组织细嫩，菌盖和菌柄颜色相对较亮；贮藏4 d后的CT组以及第5天的1∶4、1∶2组菌盖颜色变暗，且菌柄出现褐变，失水严重，秀珍菇皱缩，感官品质较差；第5天的1∶1组则在各方面相对较好。说明蓄冷剂有效地延缓了秀珍菇的自溶，且其效果在一定范围内随用量增加而增加。

图4 秀珍菇模拟运输过程中表观照片Fig.4 Photographs of Pleurotus geesteranus during simulated transportation

如图4所示，模拟运输实验中，各组在前4 d保持了较好的外观品质，第6天对照组秀珍菇菌柄显示出一定程度的褐变。蓄冷剂用量越大，秀珍菇表观特征越好，1∶1组在实验后期呈现最佳外观品质，这与模拟贮藏组结果相同。此外，运输过程使秀珍菇出现更多的机械损伤，导致其脆嫩的伞盖裂开甚至缺失。

2.3 蓄冷剂处理对秀珍菇模拟贮运过程中质量损失率的影响

图5 秀珍菇模拟贮藏（A）和模拟运输（B）过程中质量损失率变化Fig.5 Changes in mass loss during simulated storage （A） and transportation （B）

由于蒸腾作用，秀珍菇在采后水分会不断蒸发，造成秀珍菇质量减轻、鲜度下降，还使秀珍菇的代谢紊乱，呼吸作用受到影响，加剧酶促褐变，最终严重影响商品价值和货架期[23]。如图5A所示，模拟贮藏实验中，秀珍菇质量损失率随贮藏时间延长而增加，这与之前学者研究结果[24]相同。第4天时秀珍菇的质量损失率从大到小的组别分别是1∶2组、1∶4组、CT组、1∶1组，这与张艳君等[23]的实验结果趋势不同。本实验不能证明蓄冷剂对秀珍菇保鲜的正向作用，可能是秀珍菇因其伞盖脆嫩易分离，质量损失率数据有一定偏差造成的结果。

如图5B所示，模拟运输实验中，在第2天CT组和1∶1组质量损失率较高，而后1∶1组质量损失率维持相对稳定，其他组保持上升。第6天时，CT组和1∶2组质量损失率较高，1∶4组与1∶1组具有良好保持水分效果。第2天1∶1组质量损失率高可能是由于机械损伤造成菌盖缺失，脆嫩的菌盖是造成测量误差的最大因素，但通过该数据仍能得出蓄冷剂在模拟运输过程中有助于延缓秀珍菇质量损失、维持自身品质这一结论。

2.4 蓄冷剂处理对秀珍菇模拟贮运过程中色泽的影响

图6 秀珍菇模拟贮藏（A）和模拟运输（B）过程中色泽变化Fig.6 Changes in color during simulated storage （A） and transportation （B）

食用菌的色泽与其生理状态密切相关，是评判食用菌品质变化的一个重要指标，能在一定程度上反映其褐变程度[25]。如图6A1～A3所示，模拟贮藏实验中，秀珍菇L*值和a*值无明显变化，但与0 d相比，CT组b*值在第2天显著上升，且显著高于实验组（P＜0.05）。b*值升高说明试样由蓝变黄，表明在这一贮藏期间，CT组先发生褐变，说明蓄冷剂营造的低温环境能延缓秀珍菇的褐变现象。张艳君等[23]通过实验得出秀珍菇贮藏温度越高，褐变程度越严重，但其L*值在前6 d也无显著性差异，与本实验结果基本相同。

如图6B1～B3所示，模拟运输实验中，秀珍菇L*值和a*值随运输时间的延长无明显变化，b*值在运输的4～6 d显著上升（P＜0.05）。但在运输的第6天CT组、1∶4组、1∶2组之间无显著差异，无法体现蓄冷剂的保鲜效果，可能是因为秀珍菇色泽总体变化较小，秀珍菇伞盖颜色本身较深，较难观测到伞盖上的褐变。

2.5 蓄冷剂处理对秀珍菇模拟贮运过程中MDA含量的影响

MDA是由脂质中不饱和脂肪酸发生膜脂过氧化作用而产生的，它的产生和积累会对果蔬和食用菌的生物膜造成严重损伤，引起衰老[26-27]。MDA含量增加是过氧化作用加剧、膜受到损伤的重要表现，其含量越高表明膜脂过氧化作用越强，酶和膜系统受到的损伤越严重。如图7A所示，模拟贮藏实验中，在第0天秀珍菇MDA含量低，CT组的MDA含量在0～2 d显著升高，但其余实验组在2～4 d时才开始显著升高（P＜0.05）。蓄冷剂的使用使得贮藏温度降低，MDA积累减缓，这与双孢蘑菇[28]和罗汉果[29]在低温贮藏的实验结果相似，说明蓄冷剂的存在抑制了秀珍菇膜脂过氧化。然而在贮藏的第5天，1∶1组MDA含量显著高于其他组（P＜0.05），说明蓄冷剂过量也会对秀珍菇造成膜损伤。

如图7B所示，模拟运输实验中，CT组秀珍菇MDA含量在0～2 d显著上升（P＜0.05）。1∶4组和1∶2组在第6天时MDA含量才显著高于第0天（P＜0.05）。而1∶1组在贮藏过程中未发生显著改变。说明蓄冷剂有效抑制了运输过程中秀珍菇脂质氧化，且蓄冷剂与秀珍菇质量比在1∶4～1∶1范围内，蓄冷剂比例越大，抑制脂质氧化效果越好。

图7 秀珍菇模拟贮藏（A）和模拟运输（B）过程中MDA含量变化Fig.7 Evolution of MDA content during simulated storage （A） and transportation （B）

2.6 蓄冷剂处理对秀珍菇模拟贮运过程中H2O2含量的影响

图8 秀珍菇模拟贮藏（A）和模拟运输（B）过程中H2O2含量变化Fig.8 Evolution of H2O2 content during simulated storage （A） and transportation （B）

食用菌体内积累的H2O2可以直接或间接地导致细胞膜脂质过氧化，加速细胞的自溶和衰老；因此H2O2含量能够反映食用菌细胞膜脂质过氧化损害的程度。如图8A所示，模拟贮藏实验中，与0 d相比，秀珍菇的H2O2含量在第2天显著上升，其中1∶1组上升最多，而1∶4组H2O2含量相比其他组较低，说明一定比例的蓄冷剂能够抑制H2O2的产生，但过量的蓄冷剂会导致H2O2含量升高。

如图8B所示，模拟运输实验中，所有组秀珍菇的H2O2含量在2～4 d都显著上升，CT组在4～6 d继续显著上升，第6天时，实验组H2O2含量显著低于CT组（P＜0.05）。这与赵天鹏[30]的研究结果相似，即食用菌所在环境温度越高，其H2O2含量越高，说明蓄冷剂能有效抑制秀珍菇机体内H2O2的产生。但是，与模拟贮藏实验类似，在所有实验组中1∶4组H2O2含量明显低于其他组，说明蓄冷剂的增加可能对秀珍菇造成损伤。

2.7 蓄冷剂处理对秀珍菇模拟贮运过程中细胞膜透性的影响

图9 秀珍菇模拟贮藏（A）和模拟运输（B）过程中细胞膜透性变化Fig.9 Evolution of cell membrane permeability during simulated storage （A） and transportation （B）

在贮藏过程中，秀珍菇体内大分子的不饱和脂肪酸含量逐渐下降，导致自由基和活性氧含量增加，膜脂过氧化作用严重，使得其细胞膜系统的完整性受到破坏，膜渗性增强，内容物外渗，导致在贮藏后期食用菌发生严重的自溶现象；因此细胞膜透性能够反映食用菌的衰老程度和健康状态[31]。如图9A所示，模拟贮藏实验中，CT组秀珍菇的细胞膜透性在0～2 d范围内显著升高，但其余实验组在2～4 d时细胞膜透性才开始显著升高（P＜0.05），这与陈素芹[28]的研究结果相似，即低温抑制细胞膜透性的增大，说明蓄冷剂的存在保护了秀珍菇细胞膜的完整性，但是1∶1组细胞膜透性差于其他实验组，可能过多的蓄冷剂所产生的低温反而对细胞膜结构造成损伤，进而增大细胞膜透性。

如图9B所示，模拟运输实验中，CT组秀珍菇膜透性从0～2 d开始升高，1∶4组和1∶2组从第2天开始呈显著上升趋势，1∶1组在0～4 d无显著变化。运输6 d后，CT组和1∶4组细胞膜透性显著高于1∶2组和1∶1组。说明在运输过程中，蓄冷剂的使用能有效抑制膜脂过氧化，维持细胞膜系统的完整性，且蓄冷剂用量越大，维持细胞膜系统完整性效果越好。

2.8 蓄冷剂处理对秀珍菇模拟贮运过程中SOD活力的影响

图10 秀珍菇模拟贮藏（A）和模拟运输（B）过程中SOD活力变化Fig.10 Evolution of SOD activity during simulated storage （A） and transportation （B）

SOD在动物、植物、微生物和培养细胞中广泛存在，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成O2和H2O2。SOD在生物抗氧化系统中具有重要作用，能与CAT、过氧化物酶等协同作用来抵御活性氧及其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减轻机体所受的伤害[28]，是食用菌中一种非常重要的抗氧化酶[32]。如图10A所示，模拟贮藏实验中，CT组秀珍菇的SOD活力在0～1 d显著下降，并在0～3 d保持下降趋势，3～4 d时回升。而实验组的秀珍菇SOD活力下降缓慢，其下降幅度小于CT组，在第2天，各实验组SOD活力显著低于第0天（P＜0.05），2～4 d时趋于平稳，该数据与赵天鹏[30]的研究结果类似，说明蓄冷剂能够减缓秀珍菇SOD活力下降的速度。

如图10B所示，模拟运输实验中，CT组秀珍菇SOD活力在运输过程中持续显著下降（P＜0.05）。在第4天时，各实验组SOD活力显著高于CT组，在第6天时，1∶1组秀珍菇SOD活力显著高于其他组（P＜0.05）。这说明在运输过程中蓄冷剂也能减缓SOD活力下降的速度，且蓄冷剂与秀珍菇质量比在1∶1时效果最佳。

2.9 蓄冷剂处理对秀珍菇模拟贮运过程中CAT活力的影响

图11 秀珍菇模拟贮藏（A）和模拟运输（B）过程中CAT活力变化Fig.11 Evolution of CAT activity during simulated storage （A） and transportation （B）

CAT在动物、植物、微生物和培养细胞中广泛存在，是最重要的H2O2清除酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用，是防止果蔬褐变的相关酶之一[23]。如图11A所示，在贮藏期间，秀珍菇CAT活力持续上升，这可能与秀珍菇机体内H2O2含量的持续上升有关。其中，1∶1组从第1天后才开始上升，可能是过多的蓄冷剂产生的低温环境抑制了0～1 d的CAT活力，之后温度慢慢回升，也使CAT活力上升。CAT活力的增长趋势与赵天鹏[30]研究中贮藏前期的结果相似，在贮藏的第4天，各组CAT活力无显著性差异。

如图11B所示，模拟运输实验中，CT组、1∶4组和1∶2组CAT活力均呈现先显著上升后下降的趋势（P＜0.05），1∶1组上升较缓慢而后保持稳定，可能与其营造的低温环境有关。运输的第4天，1∶4组CAT活力显著高于其他组（P＜0.05），说明一定范围内使用蓄冷剂可以提升CAT活力，过量使用可能导致温度降低、CAT活力受抑制。第6天时，1∶1组CAT活力显著高于其他组（P＜0.05），这与1∶1组箱内温度回升有关。

2.1 0 蓄冷剂处理对秀珍菇模拟贮运过程中细胞结构的影响

图12 秀珍菇模拟贮藏（A）和模拟运输（B）过程中秀珍菇TEM照片Fig.12 Transmission electron microscopy images of Pleurotus geesteranus during simulated storage （A） and transportation （B）

如图12A0所示，模拟贮藏实验中，在第0天秀珍菇（鲜样）细胞内容物丰富，可以明显地看到许多线粒体、液泡等，且细胞质浓厚、细胞膜形状圆滑、整体状态较好；如图12A1～A4所示，到贮藏的第4天，各组内容物均变得稀疏，实验组内容物相对丰富，且各组均出现了一些油脂滴，可观察到细胞器结构明显变少，CT组细胞略显缩水，形态变得不规则，细胞核消失，细胞器数量明显变少，细胞黏着力下降，总体说明蓄冷剂的存在有助于保持秀珍菇的细胞形态及结构完整性。

如图12B0所示，模拟运输实验中，在第0天秀珍菇细胞内容物丰富。如图12B1～B4所示，运输的第4天，各组秀珍菇细胞中均出现了数量不等的油脂滴，说明被氧化程度高；且第4天CT组细胞内容物少，细胞核消失，细胞器数量变少，自溶程度较高；实验组内容物多，存在完整细胞核且细胞形态圆滑，说明蓄冷剂有助于维持秀珍菇的细胞形态及结构完整性。

3 结 论

蓄冷剂能够有效营造秀珍菇贮运过程中的低温环境，维持秀珍菇的外观特性、表面色泽、细胞结构完整性，减少质量损失，减缓MDA和H2O2积累，抑制SOD活力下降。这说明蓄冷剂在秀珍菇的贮藏和运输过程中能有效地抑制自溶、延缓衰老。在模拟贮藏过程中，1∶1组在抑制MDA积累、抑制细胞膜透性增加方面差于1∶4组和1∶2组，造成该结果可能是因为过多的蓄冷剂在实验前期释放的大量冷量对食用菌的细胞结构造成了损伤，使得细胞膜透性增强，细胞液渗出。1∶4组和1∶2组在维持秀珍菇各方面品质上的作用差异不大，从经济角度考虑，在秀珍菇贮藏过程中蓄冷剂和食用菌质量比为1∶4较宜。

在模拟运输过程中，1∶1组在维持秀珍菇外观特性、减少质量损失、抑制MDA积累、抑制细胞膜透性增加和减缓SOD活力下降等方面效果优于1∶4组和1∶2组；因此在本次秀珍菇的运输实验中，蓄冷剂和食用菌质量比为1∶1较宜。但是，在实际运用当中，需要考虑贮运温度、维持时间和贮运经济性等各方面因素，确定合理的蓄冷剂使用比例。