基于海泡石的细胞透性化

王 磊，刘玉雪，谭海东，刘武军，赵宗保

（中国科学院 大连化学物理研究所 生物技术部，辽宁 大连 116023）

基于海泡石的细胞透性化

王 磊，刘玉雪，谭海东，刘武军，赵宗保

（中国科学院 大连化学物理研究所 生物技术部，辽宁 大连 116023）

利用矿石纳米材料海泡石处理大肠杆菌细胞，建立高效、可逆透性化处理方法。结果表明：海泡石和大肠杆菌BW25113细胞悬液涡旋振荡，细胞通透性增强，90%以上的细胞因渗入博莱霉素致死；而在4℃修复处理过的样品，仅23%的细胞被杀死。发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）进出透性化细胞的能力与胞内外NAD浓度梯度正相关。该可逆透性化方法对生物催化和药物递送等研究具有重要价值。

细胞透性化；海泡石；博莱霉素；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；矿石纳米材料

由于存在细胞壁和细胞膜的天然屏障，生物转化过程中许多物质的胞内外传递都受到跨膜转运效率的限制。细胞透性化是指在不造成细胞裂解的情况下，改变细胞壁和细胞膜通透性，使部分非透性分子能够自由进出细胞。细胞透性化技术已广泛应用于生物技术及生命科学研究中［1-2］。根据细胞能否修复，透性化分为可逆透性化及不可逆透性化。由于可逆透性化需要严格控制处理条件，通常采用不可逆透性化处理细胞，用于提高酶稳定性及生物转化效率［3-4］。然而，当需要保证细胞存活率和保持生物催化剂稳定性时，必须采用可逆透性化。电穿孔法是最常用的可逆透性化方法，由于其效率低，通常只在实验室用于DNA转化及药物治疗［5］。经过优化的化学法也能实现可逆透性化，用于将量子点、蛋白质等纳米颗粒或分子输入细胞［6-7］。例如，采用链球菌溶血素O可在肿瘤细胞膜上造成直径约35 nm的可修复小孔，允许相对分子质量达1.00×105的活性蛋白进入细胞，加入Ca2+后约50%的细胞可修复［7］。

海泡石（分子式为H4Mg2Si3O10）是长约5 μm、直径在 10～50 nm的针状纳米矿石，远小于Escherichia coli的细胞尺寸［8］。在固体培养基表面涂布海泡石与细胞悬液可使细胞可逆透性化，实现质粒DNA转化［9］，但以涂布方式进行细胞透性化难以达到体系放大的目的。海泡石可在溶液中形成均匀的胶体状悬浊液［10］。

本文中，笔者尝试通过振荡海泡石与细胞的悬浊液使细胞透性化，用博莱霉素敏感性考察透性化的效率及透性化后的细胞存活率［11］，用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）确定细胞膜的修复时间及分子通过透性化细胞膜输送的特点，以建立了一种基于海泡石的高效、易于放大的细胞可逆透性化方法，对生物催化、药物递送研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

大肠杆菌E.coli BW25113，美国耶鲁大学大肠杆菌遗传库存中心（Coli Genetic Stock Center）；海泡石，德国 Kremer Pigmente有限公司；博莱霉素，Invitrogen公司；NAD、溶菌酶、蛋白胨、酵母粉、琼脂粉，北京鼎国生物技术有限公司；乙腈，Merck公司；其他培养基及生化试剂（醋酸铵、NaCl等），大连博诺生物化学试剂厂。

海泡石用磷酸缓冲液（PBS）（pH 7.5）配成50mg/mL贮液，NAD用去离子水配成0.25 mol/L贮液，博莱霉素用去离子水配成100mg/mL贮液。

LB培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L NaCl，用NaOH调pH至7.0，固体LB培养基加入15g/L琼脂粉，在120℃灭菌20min备用。

1.2 透性化E.coli BW25113的制备

从平板挑E.coli BW25113单菌落接种100mL LB于37℃、200r/min摇床，培养至OD600为3.4。2 000g离心6min收集菌体，菌体用PBS洗2遍并悬浮于30mL PBS中使OD600为11。将菌液与0.1体积海泡石贮液在1.5mL离心管中混合，使海泡石终质量浓度达到 5mg/mL，用美国 Scientific Industries公司生产的Vortex-Genie 2涡旋振荡器振荡处理0.5min，振荡强度为2 700r/min（最大功率）。

1.3 确定透性化效率及修复效率

取0.9mL的E.coli BW25113与5mg/mL海泡石混合后振荡0.5min进行透性化处理，立即取90 μL加入10 μL博莱霉素至终质量浓度10mg/mL，轻柔混合，剩余的透性化细胞于30℃放置30min使细胞膜修复后，取90 μL加10 μL博莱霉素至质量终浓度10mg/mL，轻柔混合。以不进行透性化处理为对照组，将E.coli BW25113和5mg/mL海泡石轻柔混合，于30℃放置30min，再加入10mg/mL博莱霉素轻柔混合。以上3种样品与博莱霉素混合后于4℃放置30min，使博莱霉素进入细胞，用PBS稀释105倍，取50 μL涂布LB平板，37℃培养24 h后进行菌落计数，只有透性化后恢复或未被透性化的细胞可以存活并形成菌落。每种样品的实验设3个平行样，实验数据为3个平行样的平均值。

1.4 确定透性化细胞膜的修复时间

通过检测NAD转运效率随修复时间的变化，确定透性化处理后细胞膜修复时间。取0.8mL的E.coli BW25113（OD600为11）与5mg/mL海泡石振荡0.5min进行透性化处理，于30℃静置使细胞膜修复0、10、20和30min。随后分别加入2 mmol/L的NAD轻柔混匀，以避免后续操作中由细胞透性产生的NAD渗漏，并于30℃静置30min使细胞膜充分修复。静置后立即洗涤菌体并浸提胞内NAD。

参照文献［12］的方法浸提检测胞内 NAD。2 000g离心6min收集菌体，用0.9mL PBS洗2遍加0.8mL的1mg/mL溶菌酶，重悬，加入0.4mL氯仿振荡1min使细胞充分裂解，16 000g离心10min，取0.7mL上层水相冻干，检测时用0.2mL醋酸铵溶解。

使用美国Dionex公司的高压液相色谱（HPLC）检测NAD浓度。色谱条件：SinoChrom ODS-BP色谱柱（4.6mm×200mm，5 μm）；流动相为 50 mmol/L醋酸铵（A）-乙腈（B）溶液（两者体积比为95∶5），等度洗脱；UVD170U紫外检测器，检测波长260 nm。

1.5 NAD输送速率与浓度梯度的关系

在E.coli BW25113悬液中加入NAD至1、2、2.5和3 mmol/L混匀，取0.8mL与5mg/mL海泡石轻柔混合，混合后振荡0.5min进行透性化处理，对照组与海泡石轻柔混合后不进行振荡处理。透性化处理样品及对照组于30℃静置20min后立即洗涤菌体并浸提检测胞内NAD，检测方法同上。透性化处理样品及对照组的差值为通过透性化的细胞膜进入或渗出细胞的NAD量。

2 结果与讨论

2.1 E.coli BW25113可逆透性化效率

由于透性化处理后，博莱霉素进入细胞而杀死细胞，可根据透性化细胞在博莱霉素存在下的存活率确定透性化效率及其中可逆透性化比率。实验发现，未经透性化处理的E.coli BW25113样品在博莱霉素存在下孵育30min后，细胞存活为每毫升（9.0±2.3）× 106个，而经透性化处理后仅为每毫升（7.0±0.6）× 105个，即透性化处理使92%的细胞受到损伤，博莱霉素进入细胞达到了致死剂量。然而，当透性化细胞在4℃静置30min，再用相同剂量博莱霉素混合处理，细胞存活回复到每毫升（7.6±1.8）×106个，这表明77%的透性化细胞可自动修复。这是因为海泡石主要通过物理作用损伤细胞膜，并且相互作用是瞬时的，不会持续破坏细胞膜的同一位置，有利于细胞自我修复。其他细胞透性化处理方法，包括表面活性剂及有机溶剂处理［4］和链球菌溶血素O处理［7］，透性化效率或可逆性低于本方法。

2.2 透性化细胞膜的修复时间

由于NAD不能自由透过完整的细胞膜，但细胞膜受损后NAD就可能跨细胞膜流动，所以可通过检测NAD转运效率随修复时间的变化规律确定透性化处理后细胞膜修复时间。将E.coli BW25113细胞与海泡石悬浊液透性化处理，于30℃静置，考察NAD渗出细胞的情况，结果见图1。由图1可知：0～20min，胞内NAD的量由8.3 μmol/g（以细胞干质量计）降到7.9 μmol/g。修复 20min后，胞内NAD的量维持稳定。结果表明，用海泡石透性化处理的E.coli BW25113细胞在30℃下20min内自动修复。

图1 透性化细胞膜的修复时间Fig.1 Resealing course of permeabilized cell membrane

2.3 NAD转运与浓度梯度的关系

将透性化 E.coli BW25113细胞在不同胞外NAD含量存在下孵育，进一步考察胞内NAD含量变化规律，结果见图2。由图2可知：当胞外NAD含量为较低时，胞内NAD倾向于扩散到胞外；而当胞外NAD含量为较高时，胞外NAD扩散进入到胞内。说明透性化处理后NAD依赖于浓度梯度跨细胞膜运动。

图2 依赖于浓度梯度的NAD透膜现象Fig.2 NAD permeation dependent on concentration gradient

3 结论

基于海泡石的大肠杆菌透性化处理方法具有高效、可逆、操作简单、易放大的特点。由于海泡石通过物理作用损伤细胞膜，没有种属选择性，预计该方法也可适用于其他微生物细胞。这种透性化处理方法将可应用于生物催化、药物递送等研究中。

［1］Hapala I.Breaking the barrier： methods for reversible permeabilization of cellular membranes［J］.Crit Rev Biotechnol，1997，17（2）：105-122.［2］刘晓华，李海星，陈燕，等.透性化细胞制备方法的研究进展［J］.食品工业科技，2011，32（11）：475-479.

［3］陈晓云，杜军，高智慧，等.恶臭假单胞菌TS1138透性化细胞的制备及其转化DL-ATC生成L-半胱氨酸的特性研究［J］.南开大学学报：自然科学版，2012，45（4）：99-104.

［4］Zhang W，O′Connor K，Wang D I C，et al.Bioreduction with efficientrecycling of NADPH by coupled permeabilized microorganisms［J］.Appl Environ Microbiol，2009，75（3）：687-694.

［5］Gehl J.Electroporation：theory and methods，perspectives for drug delivery，gene therapy and research［J］.Acta Physiol Scand，2003，177（4）：437-447.

［6］Medepalli K，Alphenaar B W，Keynton R S，et al.A new technique for reversible permeabilization of live cells for intracellular delivery ofquantum dots［J］.Nanotechnology，2013，24（20）：205101.

［7］Walev I，Bhakdi S C，Hofmann F，et al.Delivery of proteins into livingcells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（6）：3185-3190.

［8］Moran U，Phillips R，Milo R.SnapShot：key numbers in biology［J］.Cell，2010，141（7）：1262-1262.

［9］谭海东，王磊，林金涛，等.基于矿石纳米材料的DNA转化的机理初探及方法改进［J］.生物工程学报，2010，26（10）：1379-1384.

［10］Yoshida N.Discovery and application of the Yoshida effect：nanosized acicular materials enable penetration of bacterial cells by sliding friction force［J］.Recent Pat Biotechnol，2007，1（3）：194-201.

［11］Larkin J O，Casey G D，Tangney M，et al.Effective tumor treatmentusing optimized ultrasound-mediated delivery of bleomycin［J］.Ultrasound Med Biol，2008，34（3）：406-413.

［12］Sporty J L，Kabir M M，Turteltaub KW，et al.Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae［J］.J Sep Sci，2008，31（18）：3202-3211.

（责任编辑 荀志金）

Sepiolite-mediated cell permeabilization

WANG Lei，LIU Yuxue，TAN Haidong，LIU Wujun，ZHAO Zongbao
（Division of Biotechnology，Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023，China）

An efficient，reversible cell permeabilization method was developed by treatment of cells with sepiolite nanofibers.When the suspension of sepiolite nanofibers and Escherichia coli BW25113 cells were votexed，90%of the cells were found susceptible to bleomycin，whereas only 23%of the cells were susceptible upon proper resealing at 4℃.Nicotinamide adenosine dinucleotide（NAD）was either released or taken up by permeabilized cells，and the direction and rate of NAD diffusion were positively correlated to the concentration gradients across the cell membrane.This cell permeabilization method should be useful for biocatalysis and drug delivery.

cell permeabilization；sepiolite；bleomycin；nicotinamide adenosine dinucleotide（NAD）；mineral nanofiber

Q819

A

1672-3678（2015）02-0057-03

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.011

2014-03-11

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2012CB721103）

王 磊（1982—），男，山东济宁人，博士研究生，研究方向：生物化工；赵宗保（联系人），研究员，E-mail：zhaozb@dicp.ac.cn