棘白菌素B提取液脱色工艺

邹树平，刘 苗，钟 伟，牛 坤，姚黎栋，郑裕国

（1.浙江工业大学 生物工程研究所 生物转化与生物净化教育部工程研究中心，浙江 杭州 310032；2.浙江震元制药有限公司，浙江 绍兴 312071）

棘白菌素B提取液脱色工艺

邹树平1，刘 苗1，钟 伟1，牛 坤1，姚黎栋2，郑裕国1

（1.浙江工业大学 生物工程研究所 生物转化与生物净化教育部工程研究中心，浙江 杭州 310032；2.浙江震元制药有限公司，浙江 绍兴 312071）

研究碱性阴离子交换树脂WD-6对发酵棘白菌素B（ECB）提取液的脱色效果。通过对ECB提取液和ECB标准溶液的全波长扫描，确定ECB提取液中色素的最佳吸收波长为315 nm；考察了树脂添加量、脱色温度、摇床转速和脱色时间对脱色率和ECB损失率的影响，获得最佳脱色工艺：树脂添加量4% （质量分数），脱色温度30℃，摇床转速150r/min，脱色时间100min。在此条件下，ECB提取液的脱色率可达88.3%，ECB损失率仅为4.8%。

棘白菌素B；脱色；离子交换树脂

棘白菌素类抗生素是新一代临床治疗真菌感染的抗真菌药物，该类抗生素能够非竞争性抑制真菌细胞壁β-1，3-葡聚糖合成酶的活性，作用机制独特，毒副作用低，且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌抗菌活性强［1］。目前已经上市的棘白菌素类药物有卡泊芬净（caspofungin）、米卡芬净（micafungin）和阿尼芬净（anidulafungin）［2］。棘白菌素B（echinocandin B，ECB）是由构巢曲霉（Aspergillus nidulans）发酵产生的一种次级代谢产物，是合成阿尼芬净的前体化合物［3］。ECB分子式为C52H81N7O16，相对分子质量为1 060.2，化学结构式如图1所示。

图1 棘白菌素B结构式Fig.1 Structure of echinocandin B

构巢曲霉发酵生产ECB的周期较长，发酵后期有大量的色素产生［4］。ECB存在于构巢曲霉菌丝体内，用有机溶剂浸提ECB时，由于色素物质的存在，提取液一般呈橙黄色。若不经过脱色处理，不仅会降低后续产品的回收率及纯度，还会影响最终产品的色泽［5］。张雪霞等［6］在提取ECB过程中，通过树脂吸附解吸后，在解吸液中添加1%活性炭脱色，脱色不完全。Kery等［7］在用异丁醇萃取 ECB后，浓缩异丁醇相，用酸洗后加入活性炭脱色，可以使萃取液澄清，但ECB损失较大。张磊等［8］在浓缩液中加入有效组分2.5倍体积的Al2O3于20℃下脱色，虽然脱色效果良好，但使用的脱色剂Al2O3价格昂贵，难以工业化应用。本文中笔者选用广泛使用的碱性阴离子交换树脂WD-6对ECB提取液进行脱色研究，以期获得良好的脱色效果。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

高效液相色谱，日本岛津公司；酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；Eppendorf 5810R型离心机，德国Eppendorf公司；蛋白层析仪，美国Bio-Rad公司。

ECB发酵菌丝体，浙江工业大学生物工程研究所ZJB09223构巢曲霉发酵；ECB标准品，澳大利亚BioAustralis公司；WD-6碱性阴离子树脂，安徽皖东树脂有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯），中国百灵威试剂公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 ECB提取液的制备

将构巢曲霉发酵液离心，收集菌丝体，称取一定质量菌丝体，按照m（菌丝体）∶V（乙醇）=1∶1.5加入乙醇溶液，于35℃下搅拌浸提2 h，总共浸提3次。收集乙醇浸提液，用蒸馏水将乙醇稀释到体积分数40%，加入预处理好的HP20大孔吸附树脂吸附4 h，吸附完成后加入纯乙醇解吸3 h，解吸后的ECB溶液，调pH为6，即为本实验用到的样品。

1.3 树脂的预处理

将WD-6碱性阴离子树脂用质量分数5%的NaCl溶液浸泡4 h，接着用蒸馏水反复洗涤，洗净表面的NaCl，然后加入5%的NaOH溶液浸泡4 h，用蒸馏水反复洗涤，直到洗出液的pH为7，于60℃下烘干。

1.4 静态和动态吸附实验

静态吸附实验：在恒温水浴摇床中进行，测定WD-6树脂吸附前后提取液中色素的吸光值以及ECB的浓度，计算提取液的脱色率和 ECB的损失率。

动态吸附实验：在Bio-Rad蛋白层析柱中进行，装载WD-6树脂8g，通过自动收集装置，毎5mL流出液收集1次，实验完成后需测定样品收集液中色素的吸光值和ECB的浓度，计算提取液的脱色率和ECB的损失率，绘制脱色洗脱曲线图。

1.5 分析方法

1.5.1 色度的测定

在波长为200～450 nm范围内对ECB提取液和ECB标准溶液进行对比扫描，以确定提取液中色素的最佳吸收波长。

1.5.2 脱色率的计算

提取液脱色率计算按式（1）进行。

式中：A1为脱色前吸光值，A2为脱色后吸光值。

1.5.3 ECB浓度及损失率的计算

采用高效液相色谱法测定ECB的浓度，高效液相色谱条件参照文献［9］。色谱柱：伊利特Hypersil ODS2 5 μm×4.6mm×250mm；检测器为PDA；检测波长222 nm；流动相V（甲醇）∶V（超纯水）∶V（乙腈）=7∶2∶1；进样量20 μL；流速1mL/min；柱温箱40℃。ECB的损失率按照式（2）计算。

式中：ρ1和 ρ2分别为脱色前、后 ECB质量浓度（mg/L）。

1.5.4 平衡吸附量及平衡时溶液中色素浓度的测定［10］

当吸附平衡后，单位质量树脂所吸附色素的量称为平衡吸附量（g/g），用Qe表示，计算见式（3）；剩余色素的相对含量用C表示，其计算见式（4）。

2 结果与讨论

2.1 ECB提取液色度的确定

取一定ECB提取液和ECB标准液，在波长范围为200～450 nm范围内对样品进行扫描，结果如图2所示。由图2可知，有色素的提取液与标准液的吸光度最大差值在310～320 nm处，所以选取315 nm为提取液中色素的测定波长。

图2 样品和标准品全波长扫描Fig.2 Curves of wavelength scanning between sample and standard

2.2 树脂添加量对脱色效果的影响

在脱色过程中，既要保证树脂对色素尽可能大的吸附量，又要减少对ECB的吸附。取10mL ECB提取液，添加不同质量的WD-6脱色树脂，在30℃、150r/min条件下，静态吸附3 h，结果如图3所示。由图3可知：树脂添加量（质量分数）从2%增加到4%时，提取液脱色率也明显提高；但当树脂添加量超过4%后，脱色率基本不变，这可能是树脂对色素的吸附已达到平衡。而随着树脂添加量的增大，ECB损失率却不断上升，可能是树脂对ECB仍有一定的吸附作用。因此，综合考虑到脱色率和ECB损失率这2个因素，以4%作为WD-6树脂的最适添加量。

2.3 温度对脱色效果的影响

取10mL ECB提取液，添加质量分数 4% WD-6树脂，摇床转速为150r/min，在不同温度下静态吸附3 h，实验结果如图4所示。由图4可以看出：随着温度的上升，脱色率缓慢上升。这可能是由于温度上升后加速了分子扩散的速度，对色素的吸附有利，从而提高脱色率［11］。温度升高后，ECB的损失率也逐渐上升，一方面可能是由于温度的升高加速了ECB与树脂间的吸附作用；另一方面也可能是温度的升高使得ECB部分降解，导致损失率上升。因此，综合考虑，选择30℃为最佳脱色温度。

图3 树脂添加量对脱色的影响Fig.3 Effects of amount of WD-6 resin on decolouring rate

图4 温度对脱色效果的影响Fig.4 Effects of decolorization temperature on decolouring rate

2.4 摇床转速对脱色效果的影响

取20mL ECB提取液，添加质量分数4%WD-6树脂，恒温水浴摇床温度为30℃，摇床转速分别为50、100、150和200r/min，在此条件下静态吸附3 h，结果如图7所示。由图7可知，ECB的损失率并没有太大变化。对于脱色率，当摇床转速在50～150r/min时，脱色率略有上升，而随着转速继续增加，脱色率却稍有下降，可能的原因是，当摇床转速提高后，ECB提取液与WD-6脱色树脂呈高速分散状态，导致二者交换吸附并不充分，故而脱色率反而有所下降。因此，选择150r/min为脱色过程中的转速。

图5 转速对脱色效果的影响Fig.5 Effects of rotate speed on decolouring rate

2.5 脱色时间对脱色效果的影响

对于固液之间的吸附反应，达到吸附平衡过程需要一定的时间。一般吸附时间延长后，溶液中色素的浓度会越来越低，当吸附剂表面与溶液中色素浓度相等，即吸附平衡时，吸附便不再发生［12］。取50mL提取液，添加质量分数4%WD-6树脂，摇床转速设置为150r/min，于30℃下静态吸附6 h，每次间隔45min取样，测定不同时间下色素的吸光值和溶液中剩余ECB浓度，并计算提取液脱色率和ECB损失率，结果如图6所示。由图6可以看出：在前100min脱色率缓慢增加，在吸附100min后吸附基本达到饱和，但ECB损失率随时间延长继续上升。考虑到脱色效果以及ECB损失率这2个因素，确定脱色时间为100min。在此优化条件下，ECB提取液脱色率为88.3%，ECB损失率仅为4.8%。

图6 脱色时间对脱色效果的影响Fig.6 Effects of decolorization time on decolouring rate

2.6 脱色吸附等温线

目前研究吸附平衡模型的方程主要有以下3种［13］。Henry型吸附模型的表达式：G=KC+b（K、b为常数）；Langmuir型吸附模型表达式：C/G=1/ab+ C/a（a、b为常数）；Freundlich型吸附模型表达式：lg G=K+Nlg C（K、N为常数）。

根据3种吸附等温线公式，于30℃下对WD-6树脂吸附ECB提取液中色素的实验数据进行拟合，其拟合方程和相关系数见表1。

表1 吸附等温线的线性拟合结果Table 1 Result of linear model of adsorption isotherm line

由表1结果可知：3种吸附模型都可以描述WD-6树脂对ECB提取液中色素的吸附，但是比较相关系数R2，该吸附更符合Henry模型。其拟合结果如图5所示。由图5可知：此吸附等温式为线性，根据Henry模型的特点，说明该吸附是在低浓度下的吸附，并且吸附过程只存在单一分子的现象。

图7 WD-6吸附树脂的吸附等温线Fig.7 Adsorption isotherm line of WD-6 resin

2.7 动态吸附实验

准确称取经过预处理的WD-6干树脂8.0g，用湿法装柱装入蛋白层析柱中，样品总共150mL。在室温下，将流速设置为0.5mL/min进行动态脱色实验，每10min收集1管样品，通过酶标仪和高效液相色谱检测样品的吸光值和ECB的浓度，结果见图8。由图8可以看出：当流出液体积越来越大时，其脱色率下降较快。当提取液流出体积约80mL时，脱色率下降近一半；随着流出液体积增大，脱色效果越来越差，而ECB的损失率在下降到一定阶段后不再下降。可能是在动态吸附过程中，树脂与色素的接触时间较短，使得色素不能完全被吸附。而WD-6树脂对ECB有轻微吸附作用，随着时间的延长，树脂对ECB吸附饱和后，损失率不再升高。

图8 ECB提取液动态脱色曲线Fig.8 Decolrization curves of echinocandin B extract

3 结论

研究碱性阴离子交换树脂WD-6对发酵棘白菌素B（ECB）提取液的脱色效果。当WD-6树脂添加量为4%（质量分数）、脱色温度为30℃、摇床转速为150r/min、脱色时间为100min时，WD-6树脂对ECB提取液的脱色率可达到88.3%以上，而ECB损失率仅为4.8%。说明WD-6树脂能够较好地吸附ECB提取液中的色素。对WD-6树脂吸附ECB提取液中色素的吸附等温线的研究表明，该吸附反应符合Henry等温吸附模型。

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（责任编辑 管 珺）

Decoloring of echinocandin B extraction

ZOU Shuping1，LIU Miao1，ZHONG Wei1，NIU Kun1，YAO Lidong2，ZHENG Yuguo1
（1.Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of the Ministry of Education，Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China；2.Zhejiang Zhenyuan Pharmaceutical Co.Ltd.，Shaoxing 312071，China）

Decoloring of echinocandin B（ECB）extract by ion exchange resin WD-6 was investigated. Through full wavelength scanning of ECB extract and ECB standard，best absorbance of pigment was determined at 315 nm.The effects of resin（WD-6 resin）content，decoloring temperature，rotation speed and adsorption time on decoloring and loss of ECB were studied.The optimal operation conditions were as follows：resin content 4%（w/w），decolourization temperature at 30℃，rotation speed 150r/min and adsorption time 100min.Under these conditions，the decolorization rate was above 88.3%，with ECB loss rate of 4.8%.

echinocandin B；decoloring；ion exchange resin

TQ465.5

A

1672-3678（2015）02-0098-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.019

2014-03-20

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2011CB710806）；教育部博士点新教师基金（2012331712004）

邹树平（1980—），男，湖南常德人，博士，副教授，研究方向：微生物药物发酵与产业化开发；郑裕国（联系人），教授，E-mail：zhengyg@ zjut.edu.cn