鱼鳞胶原蛋白提取及对成纤维细胞功能的影响

朱 伟，张晓莉，刘 洋，王小花，李玉婷

（牡丹江医学院 基础医学院 免疫教研室，黑龙江 牡丹江 157011）

鱼鳞胶原蛋白提取及对成纤维细胞功能的影响

朱 伟，张晓莉，刘 洋，王小花，李玉婷

（牡丹江医学院 基础医学院 免疫教研室，黑龙江 牡丹江 157011）

通过水提法提取鱼鳞胶原蛋白，分离大鼠皮肤成纤维细胞，观察鱼鳞胶原蛋白对成纤维细胞增殖，细胞内血小板衍生因子（platelet derived growth factor，PDGF）、转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）mRNA表达、蛋白合成及cGMP含量的影响。结果发现：鱼鳞胶原蛋白可促进成纤维细胞增殖，并呈一定的剂量依赖关系，当质量浓度达到40mg/L时，增值率可达42.75%；鱼鳞胶原蛋白能通过促进cGMP合成，明显促进成纤维细胞PDGF、TGFβmRNA表达及蛋白合成，当质量浓度为40mg/L时，PDGF、TGFβmRNA表达量分别为对照组的1.514±0.047和1.595±0.032倍。水提法提取的鱼鳞胶原蛋白具有良好的相容性，可促进成纤维细胞增殖及活化，具有潜在的临床应用价值。

鱼鳞胶原蛋白；成纤维细胞；伤口愈合

皮肤损伤创面治疗是临床常见问题，促进创面愈合并提高愈合质量一直是研究的热点。创伤修复是由多种细胞、因子参与且相互作用的复杂过程；胶原蛋白作为细胞外基质重要的组成成分，不仅是基质的骨架蛋白，同时也可促进细胞迁移、细胞因子分泌，促进伤口愈合［1］。Chai等［2］发现：将荧光标记的鱼鳞胶原蛋白置于小鼠皮肤表面，鱼鳞胶原蛋白可透过皮肤角质层，并可活化成纤维细胞，增强皮肤的弹性及保湿性。Kempf等［3］将胶原蛋白变性后与角质细胞、成纤维细胞共同培养，发现胶原蛋白可促进角质细胞、成纤维细胞黏附和增殖。目前，天然胶原蛋白主要来源于畜类及禽类动物组织，但由于疯牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆发，使陆生哺乳动物胶原蛋白的安全性普遍受到质疑［4］。

我国水产品丰富，在加工鱼产品时会产生大量下脚料，其中鱼鳞约占总质量5%，通常被当作垃圾丢弃，每年被丢弃的鱼鳞约有30万t［4］。本室的前期工作表明：鱼鳞胶原蛋白可清除氧自由基，提高SOD、CAT含量［5］，并可促进免疫功能低下小鼠伤口愈合［6］，具有较好的生物学活性。为探讨鱼鳞胶原蛋白促进伤口愈合机制，本文提取鱼鳞胶原蛋白，以观察胶原蛋白对成纤维增殖、细胞因子分泌的影响，以期为鱼鳞胶原蛋白开发利用及损伤修复治疗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

鱼鳞取自超市生鲜部鱼类加工处，为新鲜的各种鱼鳞混合物。3日龄内Wsitar乳鼠，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。RPMI 1640培养基为Gibco公司产品，引物由上海生工生物工程有限公司合成，SYBR Premix Ex TaqTM为TaKaRa公司产品。

1.2 方法

1.2.1 鱼鳞胶原蛋白膜制备

新鲜鱼鳞清水冲洗→烘干→体积分数为1%盐酸溶液脱钙→清水、蒸馏水冲洗→调pH→烘干，备用。取适量经处理鱼鳞，捣碎，按体积比1∶30比例加入蒸馏水，100℃水浴30min，80℃水浴1.5 h，4℃、8 000r/min离心20min，取上清，经0.45 μm滤膜过滤除菌后，于超净台内自然干燥后即得鱼鳞胶原蛋白膜。采用对二甲基氨基苯甲醛比色法测定胶原蛋白特征氨基酸—羟脯氨酸的含量，测得值×11.1即为胶原蛋白的量。

提取率=提取的胶原蛋白量/鱼鳞中总的胶原蛋白量×100%

1.2.2 鱼鳞胶原蛋白对大鼠真皮成纤维细胞增殖的影响

取3日龄内的Wsitar乳鼠背部皮肤，加入质量分数为0.25%中性蛋白酶溶液，4℃酶解消化过夜，分离真皮、表皮。将真皮部分加入质量分数为0.25%的Ⅰ型胶原酶37℃酶解消化1 h。PBS溶液洗涤离心、用孔径为74 μm的细胞筛过滤去除基质成分，得到的细胞为大鼠真皮成纤维细胞［7］。

取适量无菌胶原蛋白膜，用1640培养液溶解制成质量浓度为5、10、20、40和80mg/L液体，与生长状态良好的大鼠真皮成纤维细胞4×103个共同培养于96孔板中，未加胶原蛋白孔为空白对照。培养48 h后，每孔加入MTT溶液（5g/L）20 μL，继续培养4 h。弃上清，每孔加入DMSO溶液150 μL，振荡10min，于490 nm处检测吸光度（A）值。增殖率E按以下公式计算。E=（A样品-A0）/A0×100% （A0为空白对照组吸光度值；A样品为胶原蛋白组吸光度值）。

1.2.3 鱼鳞胶原蛋白对大鼠真皮成纤维细胞PDGF、TGFβ mRNA表达的影响

将生长状态良好的大鼠真皮成纤维细胞2×105mL-1与鱼鳞胶原蛋白40mg/L共同培养于6孔板中，未加胶原蛋白孔为空白对照。培养4、8和24 h后收集细胞，利用Trizol试剂法提取RNA。取1 μg RNA利用M-MLV逆转录酶法合成cDNA。Real time PCR采用SYBR Green染料法，PDGF上游引物为5′-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-3′，下游引物为5′-TTGGCCACCTTGACGCTGCCG-3′。TGFβ上游引物为5′-GCTAATGTTGTTGCCCTCCTAC-3′，下游引物为5′-GGACTTTGGTGTGTTGAGTGTC-3′。PCR反应条件：50℃、2min，94℃、10min，1循环；94℃、15 s，60℃、1min，40循环。以GADH为内参基因，用2-ΔΔCt法处理数据。

1.2.4 鱼鳞胶原蛋白对大鼠真皮成纤维细胞PDGF、TGFβ蛋白表达的影响

将生长状态良好的大鼠真皮成纤维细胞2× 105mL-1与鱼鳞胶原蛋白40mg/L共同培养于6孔板中，未加胶原蛋白孔为空白对照。培养24 h后收集细胞，经PBS洗涤2次后，溶于裂解液中，冰上放置30min，4℃、12 000r/min离心10min，利用BCA蛋白测定试剂盒定量蛋白。将蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，转移到PVDF膜上。膜经含质量浓度为50g/L脱脂奶粉的TBS室温封闭1 h，加入抗PDGF、TGFβ、GAPDH抗体，4℃过夜，TBST洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，共同孵育2 h，利用化学发光法进行检测。以GADPH为内参基因，目的蛋白相对含量以目的蛋白光密度值与内参光密度的比值来表示。

1.2.5 鱼鳞胶原蛋白对大鼠真皮成纤维细胞cGMP含量的影响

将生长状态良好的大鼠真皮成纤维细胞2× 105mL-1与鱼鳞胶原蛋白40mg/L共同培养于6孔板中，未加胶原蛋白孔为空白对照，培养2、4和8 h后收集细胞，用直接加热法制备cGMP待测样品，通过试剂盒、利用125I同位素标记竞争蛋白结合放射免疫法测定cGMP含量。

1.2.6 统计学处理

应用SPSS 17.0软件，通过t检验进行统计学分析，数据以±s表示，p＜0.05为差异有统计学意义，p＜0.01为差异具有显著性统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 鱼鳞胶原蛋白膜的制备

目前常用的胶原蛋白提取方法有水提法、酸法、碱法和酶法等，主要的方法为酸法及酶法，但该提取方法繁琐、时间长，成本高，且大量腐蚀性物质对生产设备要求较高，不适合大规模生产。本室前期工作表明［5］：与酸法相比，水提法同样可以有效地提取鱼鳞胶原蛋白，故本研究采用水提法提取鱼鳞胶原蛋白，提取率为64.5%，且提取的胶原蛋白呈膜性良好，所制的胶原蛋白膜见图1。

图1 鱼鳞胶原蛋白膜Fig.1 Fish scale collagenmembrane

2.2 鱼鳞胶原蛋白对成纤维细胞增殖的影响

成纤维细胞是构成肉芽组织的主要成分之一，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。成纤维细胞还可分泌TGFβ、PDGF、FGF等多种细胞因子，通过多途径参与修复过程。本研究前期工作表明：鱼鳞胶原蛋白可促进免疫低下小鼠伤口愈合［7］，为探讨鱼鳞胶原蛋白作用机制，本研究分离大鼠乳鼠皮肤成纤维细胞，体外观察其对成纤维细胞功能的影响。首先观察对成纤维细胞增殖的影响，结果见图2。由图2可知，当鱼鳞胶原蛋白质量浓度达到40、80mg/L时，增值率分别可达42.75%、44.36%。

图2 鱼鳞胶原蛋白对成纤维细胞增殖的影响Fig.2 Effect of fish scale collage on proliferation of fibroblast cell

2.3 鱼鳞胶原蛋白对成纤维细胞TGFβ mRNA表达及蛋白合成的影响

TGFβ是促进伤口愈合的重要调控因子，活化的TGFβ可趋化成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞向伤口处聚集，并且TGFβ可活化成纤维细胞、巨噬细胞，促进IL-1、PDGF、TGF生成，促进整合素，胶原蛋白、弹力蛋白等细胞外基质合成，增强细胞与细胞外基质的相互作用［8］。为探讨鱼鳞胶原蛋白促进伤口愈合的机制，观察鱼鳞胶原蛋白对成纤维细胞TGFβ mRNA表达及蛋白合成的影响。结果表明：胶原蛋白40mg/L与成纤维细胞共同培养8 h即可明显促进TGFβ mRNA表达，mRNA相对表达量可达1.595±0.032（图3），并可促进蛋白合成（图4）。

图3 鱼鳞胶原蛋白对TGFβ mRNA表达的影响Fig.3 Effect of fish scale collage on TGFβ mRNA expression

图4 鱼鳞胶原蛋白对TGFβ蛋白表达的影响Fig.4 Effect of fish scale collage on TGFβ protein expression

2.4 鱼鳞胶原蛋白对成纤维细胞PDGF mRNA表达及蛋白合成的影响

PDGF是第一个批准临床用于治疗皮肤损伤的细胞因子，Nagai等［9］、Mandracchia等［10］用Becaplermin（重组人PDGF）治疗糖尿病患者的皮肤溃疡，发现Becaplermin可促进细胞的迁移、增殖，促进细胞因子的产生，促进伤口愈合。为探讨鱼鳞胶原蛋白促进伤口愈合的机制，观察鱼鳞胶原蛋白对成纤维细胞PDGF mRNA表达及蛋白合成的影响。结果表明：胶原蛋白40mg/L与成纤维细胞共同培养8 h即可明显促进PDGF mRNA表达，mRNA相对表达量可达1.514±0.047（图5），并可促进蛋白合成（图6）。

图5 鱼鳞胶原蛋白对PDGF mRNA表达的影响Fig.5 Effects of fish scale collage on PDGF mRNA expression

图6 鱼鳞胶原蛋白对PDGF蛋白表达的影响Fig.6 Effects of fish scale collage on PDGF protein expression

2.5 鱼鳞胶原蛋白对成纤维细胞cGMP含量的影响

cGMP是细胞内重要的第二信使，可活化多种胞内信号传导途径，与细胞分裂、增殖及活化密切相关。成纤维细胞内cGMP活化可使细胞合成大量胶原蛋白。上述实验表明：鱼鳞胶原蛋白可促进成纤维细胞TGFβ、PDGF mRNA表达及蛋白合成，为探讨对胞内信号通路的影响，观察鱼鳞胶原蛋白对cGMP含量的影响。结果表明：鱼鳞胶原蛋白40mg/L可使成纤维细胞内cGMP含量明显增多，作用8 h，可使cGMP含量达到（1.321±0.097）pmol/mL（图7）。

3 结论

水提法提取的鱼鳞胶原蛋白具有良好的生物相容性，可以剂量依赖的方式促进成纤维细胞增殖，当质量浓度达到40mg/L时，增值率可达42.75%，并可通过诱导cGMP合成，活化cGMP介导的信号传导系统，促进成纤维细胞TGFβ、PDGF mRNA表达及蛋白合成。结果表明：水提法提取的鱼鳞胶原蛋白具有良好的生物相容性及促进成纤维细胞功能活性的作用，其临床应用价值值得进一步深入研究。

图7 鱼鳞胶原蛋白对cGMP合成的影响Fig.7 Effect of fish scale collage on cGMP protein expression

［1］Kolácná L，Bakesová J，Varga F，etal.Biochemicaland biophysical aspects of collagen nanostructure in the extracellular matrix［J］.Physiol Res，2007，56（S1）：51-60.

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［4］黄焕，王欣，刘宝林，等.木瓜蛋白酶水解鱼鳞胶原蛋白的工艺研究［J］.食品科学，2009，30（24）：23-25.

［5］朱伟，张歆，黄山凌子.鱼鳞胶原蛋白提取及抗氧化活性初探［J］.食品科技，2012，37（10）：204-206.

［6］朱伟，张晓莉，刘洋，等.鱼鳞胶原蛋白对免疫低下小鼠皮肤伤口愈合的影响［J］.哈尔滨医科大学学报，2014，48（3）：177-181.

［7］王彦庄，徐尔真，王秋荣.家兔皮肤创面成纤维细胞的传代培养［J］.中华创伤杂志，1993，9（2）：99.

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［9］Nagai M K，Embil J M.Becaplermin：recombinant platelet-derived growth factor，a new treatment for healing diabetic foot ulcers［J］. Exp Opin Biol Ther，2002，2（2）：211-218.

［10］Mandracchia V J，Sanders S M，Frerichs J A.The use of becaplermin（rhPDGF-BB）gel for chronic nonhealing ulcers：a retrospective analysis［J］.Clin Pediatr Med Surg，2001，18（1）：189-209.

（责任编辑 周晓薇）

Effect of fish scale collagen on fibroblast function

ZHU Wei，ZHANG Xiaoli，LIU Yang，WANG Xiaohua，LI Yuting
（Department of Immunology，School of Basic Medical Sciences，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China）

Water-soluble collagens were isolated from fish scale，and the effect of fish scale collagen on fibroblast proliferation，PDGF and TGFβ mRNA expression，and the concentration of cGMP were studied. The results showed that the proliferation of fibroblasts was upregulated in a dose-dependent manner，and the relative growth rate was increased 42.75%treated with scale collagen（40mg/L）PDGF，TGFβ mRNA expression and protein production were significantly promoted，and treating with scale collagen（40mg/L），the relative mRNA expression of PDGF and TGFβ were increased 1.514±0.047 and 1.595± 0.032.Water-soluble fish scale collagen were biocompatible，could enhance fibroblast cell activity，and would be favorable as wound healing material.

fish scale collagen；fibroblast；wound healing

R285.5

A

1672-3678（2015）02-0053-04

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.010

2014-09-19

黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12531748）

朱 伟（1971—），女，浙江省绍兴市人，博士，副教授，研究方向：免疫药理学，E-mail：zhuzwwei@163.com