食品中生物胺含量及生物胺氧化酶的研究进展

李彬彬，徐 晔，牛淑慧，张 楠，李 玮，宋桂森，张若瑶，杨 勇*

（四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014）

生物胺（biogenic amines，BA）是一类广泛存在于食品尤其是发酵食品中的具有潜在毒性的生物活性物质，发酵食品中BA主要是在微生物的作用下通过氨基酸脱羧生成。适量的BA对人体具有一定生物活性[1]，但摄入过量的外源BA则会危害人体健康[2-7]。体外实验研究表明一些从手工乳酪和葡萄酒中分离的肠球菌和乳杆菌能够在类似人体肠道环境中产生酪胺和腐胺，同时其产生的酪胺、腐胺可增强菌株在该环境中的存活能力[8-9]。此外，de Fernández等[8]研究发现坚忍肠球菌产生的酪胺导致对Caco-2人体上皮细胞的高附着力和免疫调节作用。以上研究结果表明食品中产生BA的菌株能够在肠道内环境中存活并产生BA。因此减少食品尤其是发酵食品的BA含量，控制产BA菌株的生长就显得尤为重要。

面对发酵食品生产加工过程中高BA含量的问题，常采取的措施主要有：1）降低前体物氨基酸水平[10]；2）抑制腐败微生物的生长[11]；3）使用不产氨基酸脱羧酶的发酵剂[12-14]。当这些方法都无法有效降低BA含量时，可采用添加微生物或BA降解酶的方法[15-16]。国内外许多学者通过接种不具有产氨基酸脱羧酶活性而具有BA氧化酶（amine oxidases，AOs）活性的微生物来降解食品中的BA[11,17-18]，取得了良好的效果，其中起关键作用的就是AOs。

AOs是BA代谢中的关键酶，其分离纯化和降解特性一直是近年来国内外BA降解研究的热点。更有学者将AOs加入到发酵食品中，探究其在食品内环境中对BA的降解情况，发现AOs能显著降低BA含量，且效果优于添加微生物，因而应用AOs解决食品中高BA含量问题具有良好的前景。

1 食品中BA的含量

鱼及鱼制品、发酵香肠、乳酪、酒类以及酱油等食品中的微生物是其品质形成的重要因素，该类食品在蛋白酶的作用下含有丰富的游离氨基酸，但当存在具有氨基酸脱羧酶活性的微生物时，容易形成BA。目前国际上对食品中BA含量并无统一的标准，并且对BA的限量主要集中在水产品和葡萄酒中，涉及的BA主要为组胺和酪胺（表1）。

表1 不同国家及地区对BA的限量标准Table1 Maximum limits for biogenic amines in different countries

1.1 鱼制品

鱼制品营养丰富，具有大量高品质的蛋白质，因而容易受到微生物的污染，生成大量的BA。在鱼制品中，组胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺和亚精胺是主要的BA，通常通过检测组胺、尸胺、腐胺的含量来判断鱼产品是否变质[24]。因此，通过监测BA水平来评估产品的新鲜程度就显得尤为重要。在水产品中，组胺是最常被检测的BA，在许多国家均有限量标准，Bilgin等[25]分别检测了沙丁鱼罐头、鲭鱼罐头、金枪鱼罐头和腌凤尾鱼样品中5 种BA的含量，发现组胺和尸胺是最主要的BA。研究发现沙丁鱼、鲭鱼、鳀鱼等为高组胺鱼类，鱼制品的贮藏温度对高组胺鱼类中组胺的形成有重要的影响，当在22 ℃贮藏12 h后，沙丁鱼和鲭鱼中组胺含量达到50 mg/kg，而鳀鱼在35 ℃贮藏8 h后，组胺含量甚至可达到254 mg/kg[26-27]。

1.2 发酵香肠

关于肉制品中BA含量并没有统一的限量标准，为了保证产品的质量及安全性，有学者建议将肉制品中组胺和酪胺限量值均设为100 mg/kg[28]。研究发现在欧式发酵香肠中酪胺是主要的BA，其次是腐胺和尸胺，酪胺、腐胺和尸胺的最高含量可达773.43、648.85、620.96 mg/kg[29]。在传统中式香肠中，组胺和酪胺是主要的BA，且含量均超过100 mg/kg，此外腐胺、尸胺等其他BA均有检出[30]。Papavergou等[31]检测的50 个希腊发酵干香肠中，除精胺和亚精胺外，其余的BA含量有较大变化，其中酪胺、腐胺、组胺和尸胺的含量范围分别为0～510、0～505、0～515 mg/kg和0～690 mg/kg。由此可见，组胺、酪胺、腐胺、尸胺是发酵香肠中主要的BA。精胺和亚精胺主要来源于原料肉，且在加工过程中含量变化不显著。

1.3 乳酪

由于蛋白质水解是乳酪品质形成的最主要的过程，因此乳酪很容易形成BA。总的来说，乳酪中BA的含量和类型不仅取决于原料乳及其加工处理过程和其所采用的发酵剂，还与乳酪成熟的条件、成熟后的处理方式、包装类型、贮藏温度和时间有关，并且乳酪不同部位BA的含量和类型也有很大差异[32-33]。Schirone等[34]发现直接经原料乳发酵制成的乳酪总BA含量可高达5 860.6 mg/kg，经巴氏杀菌的原料乳制成的乳酪中BA含量相对较低，为10.3～582.4 mg/kg，表明原料乳的卫生质量和加工前处理对BA含量有着重要的影响。此外，研究表明成熟时间较短的乳酪BA含量低于成熟时间较长的乳酪，因为随着时间的延长乳酪中蛋白质水解水平和氨基酸代谢水平也在逐步增加[35]。Guarcello等[36]对20 个乳酪样品中BA含量检测发现，组胺、酪胺、腐胺、尸胺含量差别很大，有的甚至可达900 mg/kg，50%样品中至少有一种BA的含量处于潜在毒性含量范围（超过100 mg/kg）。

1.4 酒类

研究证实当乙醇体积分数低于10%时可增加氨基酸脱羧酶活性[37]，乙醇体积分数12%时能抑制胺氧化酶活性[38-39]，一定体积分数的乙醇能促进BA的生成、抑制BA的降解。因此，与其他食品相比，酒类食品中的BA含量有更为严格的限量要求。许多国家均对葡萄酒中BA质量浓度制定了严格的限量标准，其中德国规定最严格，为不超过2 mg/L[38]。葡萄酒中BA的形成和乳酸菌有关，当内源乳酸菌达到充足水平时，葡萄酒的苹果酸-乳酸发酵就会自发开始。在苹果酸-乳酸发酵过程中，乳酸菌主要通过麦芽酸酯酶将L-马来酸转化为L-乳酸，该酸是一种中酸性物质，能增强细胞的活性，从而提高微生物的稳定性[40]。因此，苹果酸-乳酸发酵被认为是红酒生产的一个关键阶段，但也正是在这个发酵过程中产生了大量的BA[41]，当酒的发酵条件有利于BA形成时，自发的苹果酸-乳酸发酵就会导致BA的大量累积。有研究报道在这个过程中BA质量浓度接近30 mg/L[42]。葡萄酒中BA含量与葡萄和葡萄汁的氨基酸含量、年份、SO2浓度、酸度、酿造条件、酒糟含量以及细菌氨基酸脱羧酶活性等有关[42-48]。葡萄酒中BA的含量也与葡萄酒的类型有关，一般认为红葡萄酒中BA含量比白葡萄酒高。Kántor等[49]对25 种斯洛伐克葡萄酒中8 种BA质量浓度进行测定后发现，在所有样品中，苯乙胺、尸胺、组胺、亚精胺均没有检出，酪胺、腐胺、精胺均有检出，但腐胺和精胺的质量浓度很低，色胺质量浓度最高（（170.9±5.3）mg/L）。除葡萄酒外，对白酒和黄酒中的BA也有相关研究报道。研究发现酪胺和腐胺是黄酒中主要的BA[50]。Zhong Jianjun等[51]测定39 个不同厂家的黄酒样品，其中5-羟色胺、腐胺、酪胺、尸胺、组胺为主要的BA，它们的平均质量浓度分别为53.3、24.3、19.2、9.08、8.83 mg/L，BA总质量浓度平均为115 mg/L。范文来等[52]研究发现白酒中BA质量浓度与其他酒类食品相比是最低的，这可能与BA在蒸馏过程中大部分被蒸馏出来有关，从而使其未进入酒中。因此，加强对酒类食品中BA质量浓度的监控，降低BA含量，是提高酒类食品安全性的关键，也是保障我国酒类食品打入国际市场的关键。

1.5 酱油

酱油是我国传统的发酵食品，是人们生活中必不可少的调味品。发酵过程中，其在微生物和蛋白酶的作用下产生大量的氨基酸，进而容易产生BA，威胁酱油的安全性。Lu Yongmei等[53]检测了40 种不同厂家的酱油，发现酪胺是最主要的BA，BA总质量浓度高达1 357 mg/L。该研究还发现酱油中BA质量浓度与氨基酸态氮水平呈明显的正相关性。不同样品的BA种类和含量虽存在差异，但大多数研究表明酪胺、腐胺、苯乙胺是质量浓度较高的BA[54-55]。

2 AOs的分类及其影响因素

目前，常通过控制前体物水平、BA产生菌株的生长、氨基酸脱羧酶活性以及增强AOs活性来降低发酵食品中的BA含量。由于采用控制腐败微生物生长的方法来降低食品中BA含量存在一定的局限性，不能有效减少已生成的高含量BA，仅仅依靠提高原材料卫生质量、降低微生物污染水平不足以完全或有效避免BA的形成，还须要结合其他措施来减少食品中BA的形成，提高BA的降解。其中AOs是研究BA降解的关键酶。

2.1 AOs的分类

AOs是由BA降解菌株合成的，能够将已生成的BA分解成相应的醛、氨气和过氧化氢的一类酶[56-57]，广泛存在于动植物和微生物体内。在动植物体内，其可通过调节细胞内胺的含量及生成产物的浓度来参与生物机体的生成发育过程，并对各种逆境胁迫作出相应的适应性调整[58-59]；在微生物体内其可通过诱导产生，在食品中以具有AOs活性的微生物为发酵剂能有效降低BA含量。到目前为止，发现的AOs已有含核黄素的单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）（EC.1.4.3.4）、腐胺氧化酶（EC.1.4.3.10）、含铜的初级胺氧化酶（EC.1.4.3.21）和含铜的二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）（EC.1.4.3.10）。

AOs分为MAO、DAO和多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）。MAO多属于含铜氧化酶[60]，由于最先发现的MAO以酪胺为底物，又叫酪胺氧化酶。MAO在动物体内分布广泛，在代谢BA方面起着主要的作用，在原核生物如肠杆菌属、铜绿假单胞菌等中也有发现[61]。微生物中的AOs在自发的生物活性或BA分解过程中具有重要的作用。有研究从黑曲霉中分离纯化出MAO[62]。通过测压法和辐射测定法发现该酶是膜结合的酶，并且和芳基硫酸酯酶的合成有关[63-64]。

DAO主要作用于组胺和腐胺，用来调节其在组织中的水平，属于含铜的AOs。DAO的来源主要有猪肝脏、肾脏、人类胎盘、血浆，以及绿脓杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌等微生物。腐胺在DAO的作用下可转化成氨基丁醛，进而氧化成吡咯啉[65]。

PAO是指所有能氧化多胺类物质的酶，是催化多胺氧化降解的关键性酶。既有含黄素腺嘌呤二核苷酸（f l avine adenine dinucleotide，FAD）的PAO，又有含铜的PAO，含铜的PAO作用于一级氨基，而含FAD的PAO除作用于一级氨基外，还可作用于二级和三级氨基[66]。

2.2 AOs活性的影响因素

AOs活性受底物、BA、抗组胺药物和食源性抑制剂的影响，如乙醇、肌肽、硫胺素、酪胺、尸胺等均能降低其活性[67]。AOs对BA的降解没有严格的特异性，一种AO至少能降解一种BA，其底物特异性和作用位点存在相关性差异。Leuschner等[68]研究了发酵食品中的微生物对组胺和酪胺的降解能力，发现27 株乳酸菌、21 株扩展短杆菌和似棒状杆菌均能降解组胺和酪胺，这些微生物的酶活力呈现不同的定量水平。有研究认为BA本身也有抑制AOs活性的作用，如酪胺能够抑制MAO的活性，色胺能够抑制DAO的活性[18]。

除此之外，食品的加工贮藏条件在很大程度上影响着AOs活性。有研究表明，DAO在中性和碱性环境下其酶活性最大，并且氧气在该酶反应中是不可缺少的。异变微球菌LTH 1540菌株对酪胺的降解严格地受pH值（最适pH值为7.0）、温度、NaCl浓度以及葡萄糖和肼屈嗪浓度的限制，且在有氧条件下该酶的活性较高[68]。微生物AOs降解BA的能力依赖于环境条件，在适宜条件下，发酵香肠中木糖葡萄球菌S81在体外可完全降解组胺和部分酪胺，但是由于体内低氧气体积分数、低pH值和高盐浓度等恶劣的环境条件，这些微生物的AOs活力不能在体内定量重现[69-70]。

由此可见，食品的环境条件，尤其是加工贮藏温度、pH值、盐浓度是影响AOs活性的重要因素。在发酵食品中，加工贮藏的温度、pH值、盐浓度和氧气体积分数等在控制食品中微生物数量、防止腐败微生物污染的同时，也影响着AOs活性，不利于其发挥作用。因此，在将AOs应用于食品中控制BA含量时，必须充分考虑食品的环境条件对AOs活性的影响，在不影响食品品质的前提下，可以最大限度地创造有利于AOs发挥降解作用的环境条件，保证食品的质量安全。

3 AOs产生菌株

食品中的BA是食物组成和微生物群体酶活性之间复杂作用的结果，因此筛选不产氨基酸脱羧酶且具有较高AOs活性的菌株作为发酵剂是降低食品中BA含量的有效途径。在发酵食品的发酵剂中，含有AOs的微生物主要是乳酸菌和葡萄球菌。有研究证实具有AOs活性是植物乳杆菌的一般特性[71]。Xie Chong等[72]将植物乳杆菌、木糖葡萄球菌作为香肠的发酵剂，发现木糖葡萄球菌只能轻微地降低酪胺（21%）、组胺（25%）和尸胺（22%）的质量分数，而接种混合发酵剂和植物乳杆菌的实验组均能有效地降低色胺（100%）、苯乙胺（100%）、腐胺（86%）、尸胺（63%）、组胺（82%）和酪胺（43%）的质量分数，说明植物乳杆菌能强烈地抑制BA的产生，具有高AOs活性。Zhang Huichao等[73]研究发现鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌以及植物乳杆菌均能够产AOs，并以此为发酵剂接种到熏马肠中，研究在香肠成熟过程中这些菌株对BA含量的影响，结果显示这6 株菌均能不同程度地降解发酵香肠中的BA，降解程度超过40%。Fadda等[74]对53 株乳酸菌BA降解能力的研究表明，干酪乳杆菌和植物乳杆菌具备MAO活性，其中干酪乳杆菌CRL705的MAO活性最高，能降解98%的酪胺。Guarcello等[75]从最具活性的副干酪乳杆菌亚种CB9CT中纯化出了BA多铜氧化酶，通过对乳酪中乳酸菌BA降解酶活性的研究发现，编码多铜氧化酶的基因也存在于其他能降解BA的乳酪发酵剂中。Martuscelli等[17]研究了木糖葡萄球菌对BA的降解能力，发现S81氧化酶活性最高，能100%降解组胺，其次分别为S206（93%）、S79（68%）和S90（53%）。除乳酸菌和葡萄球菌外，从食品中也分离到了其他具有AOs活性的微生物。Lee等[76]将具有AOs活性的多粘芽孢杆菌D05-1作为发酵剂添加到咸鱼中，研究在发酵过程中该发酵剂对组胺等BA的降解情况，结果证实该发酵剂不仅能显著抑制需氧型微生物的生长，还可降低34.0%的组胺以及30.0%的BA总量。表明接种具有AOs活性的发酵剂是减少BA积累的有效方法。真菌中黑曲霉最早被证实具有AOs基因，可在适宜的条件下诱导产生AOs[77]。黄瑶等[78]用黑曲霉AOs的粗酶液分别对自制酱油和市售酱油进行处理，发现在自制酱油中粗酶液对BA的降解率为78.29%，其对市售酱油中BA的降解率为69.5%。

4 AOs的降解特性

目前食品中AOs的应用研究主要集中在发酵剂的筛选中，而从发酵剂中分离纯化出AOs并运用于食品的研究较少。为了提高AOs的降解效率及降解活性，必须进一步了解AOs的降解特性。最早研究微生物AOs的是Yamada等[62,79-80]，他们从黑曲霉中分离纯化出了一种铜胺氧化酶，并对其特性作了一系列研究，发现每摩尔铜胺氧化酶含有3 g铜离子，其在磷酸盐缓冲液中稳定，适宜pH值范围为6.0～7.0，最适温度为35 ℃，当温度超过40 ℃时其结构被迅速破坏。透析除去铜离子后，该酶的活性也随之丧失，当重新添加铜离子后活性恢复，表明在含铜胺氧化酶中，铜离子对酶活性有着重要的影响。随后，Haywood等[81]以葡萄糖为碳源、一系列胺为唯一氮源，从博伊丁假丝酵母中分离纯化出了甲胺氧化酶和苄胺氧化酶，并研究了这两种初级胺氧化酶的特性，结果显示苄胺氧化酶在45 ℃和50 ℃时比甲胺氧化酶更加稳定，两种酶的最适pH值均为7.0，有共同底物，并且两种酶均对羰基试剂、铜离子螯合剂以及其他DAO抑制剂敏感。研究还证实了这两种酶具有相对分子质量（relative molecular mass，Mr）约为80 000的相似亚基，但苄胺氧化酶通常为Mr 136 000的二聚体，甲胺氧化酶（Mr 510 000）主要以八聚体的形式存在。2004年，Sekiguchi等[82]从成晶节杆菌KAIT-B-007中分离纯化出了热稳定组胺氧化酶，并研究了其酶学特性。原子吸收光谱结果显示每摩尔该酶含有1 个铜离子，同时铜离子对组胺氧化酶活性有重要的影响。Foster等[83]通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤等方法从不透明红球菌中分离纯化出了两种天然含铜AOs，并对这两种初级胺氧化酶的功能表达和动力学特性进行了研究。通过改变生长底物，发现目标氧化酶活性有不同程度的改变，脂肪族、芳香族胺以及多种结构类似物的米氏动力学常数表明氧化酶具有广泛的特异性，并且对C1～C5脂肪族单胺和芳香族胺有较高的亲和力，米氏常数的范围为0.1～0.9 mmol/L和小于0.2 mmol/L。研究发现在腐胺降解路径中，AOs和4-氨基丁酸醛脱氢酶共同作用于腐胺的降解，腐胺氧化酶将腐胺脱氨生成4-氨基丁酸醛，该物质在4-氨基丁酸醛脱氢酶的作用下形成4-氨基丁酸，再在氨转移酶和脱氢酶的作用下最终形成琥珀酸盐代谢腐胺[65]。Callejón等[84]分别从植物乳杆菌J16和乳酸片球菌CECT 5930中分离纯化出能在葡萄酒中降解腐胺、酪胺、组胺的酶，并鉴定为多铜氧化酶，纯化的蛋白对组胺、酪胺、腐胺的降解率分别为36%、80%、17%。克隆植物乳杆菌J16 CECT 8944中降解BA的新漆酶基因并在大肠杆菌中异源过表达，对漆酶的纯化和生化表征研究发现，纯化的漆酶具有多铜氧化酶活性，主要降解酪胺[84]。

也有报道将AOs添加到食品中研究其对BA的降解情况。黄瑶等[78]研究了黑曲霉AOs的粗酶液，发现在酱油中添加该粗酶液能有效降低BA含量，其最适温度为35 ℃，最适pH值为7.0，最佳底物为正己胺，并且铜离子对其酶活性有激活作用，乙二胺四乙酸等能抑制其酶活性。Naila等[85]将DAO加入到鱼酱（盐质量分数1%、pH 6.0）中，发现DAO将组胺降解到不可检测水平（小于0.1 mg/L），且研究结果表明将AOs加入到食品中能有效去除食品中的BA，效果优于微生物。然而发酵食品复杂的环境条件，主要是低pH值的环境在抑制微生物生长繁殖的同时，也降低了大多数AOs的活性。因此采用加入酶的方法来降低食品中BA含量时，需要测定不同食品的适宜环境条件（如pH值）对酶活性的影响。

5 结 语

许多研究对我国传统发酵食品中BA含量进行了报道，发现通过接种适宜的发酵剂能够降低食品中BA含量。但当前大量研究表明控制食品的微生物群落尤其是使用不产BA的发酵剂，虽然能降低BA含量，但该方法不能有效抑制污染菌株产生BA。目前国内外对降低BA的研究大多集中在从食品中筛选具有BA降解活性的微生物，并以此为发酵剂，但对于在我国传统发酵食品中AOs的分离纯化，以及将纯化后的酶应用于食品并研究其降解特性鲜见报道。虽然有许多研究表明在实验条件下AOs能有效降解已生成的BA，但在实际的加工操作过程中，食品复杂的环境条件会影响AOs的降解能力；因此，对食品中AOs的分离纯化及其降解特性的进一步研究对BA的降解具有重要意义，同时也为发酵食品的质量控制提供了新的思路。