籼粳稻两个品种大米储藏过程中蛋白质氧化对其蒸煮食用品质的影响

吴晓娟，吴 伟*

（中南林业科技大学食品科学与工程学院，稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖南 长沙 410004）

中国是世界上最大的水稻生产国和消费国，全国65%以上的人口以大米为主食[1]。随着生活水平的提高，人们对大米的品质尤其是食味品质提出了更高的要求[2]。但大米在储藏过程中会发生细胞结构损伤、化学成分改变、营养组分流失等一系列变化，导致加工特性和食味品质的下降。长期以来，淀粉的组成和结构变化被认为是影响大米及其制品糊化特性和食味品质的主要因素[3-4]。但越来越多研究发现，大米中蛋白质的组成和结构在储藏过程中也会发生显著变化，如清蛋白和球蛋白含量显著下降，米谷蛋白结构发生显著变化，蛋白质平均分子质量显著增加等[5-8]。这可能是由于大米中脂肪氧合酶产生的脂质自由基和部分挥发性羰基化合物具有高度的氧化活性，使蛋白质发生氧化聚集和结构变化[9]。大米胚乳中淀粉颗粒由支链淀粉分子以疏密相间结晶区和无定形非结晶区组成，中间掺杂螺旋结构直链淀粉分子，蛋白质则分布在淀粉颗粒的外周，蛋白质氧化产生的共价交联必定会影响大米淀粉糊化特性和米饭的食味品质[10]。‘金优207’是中国长江中下游稻区的主栽优质晚籼稻品种[11]，‘吉粳88’是中国东北稻区的主栽优质粳稻品种[12]，都具有较好的食味品质。本研究以新收获大米‘金优207’和‘吉粳88’为原料，采用温度37 ℃、相对湿度85%的条件进行加速陈化储藏，测定储藏过程中大米蛋白羰基、巯基和二硫键含量等氧化特征指标的变化，并将这些氧化特征指标与米粉糊化特性、米饭质构特性和感官品质进行相关性分析，研究蛋白质氧化对大米蒸煮食用品质的影响，以期为大米及其制品的保鲜储藏提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新收获大米（‘金优207’、‘吉粳88’） 湖南粮食集团有限责任公司；牛血清白蛋白 上海源叶生物科技有限公司；5,5’-二硫代二硝基苯甲酸盐（5,5’-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB） 美国Sigma-Aldrich公司；盐酸、氢氧化钠、无水乙醇等（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

RXZ-128A型人工气候箱 宁波市科技园区新江南仪器有限公司；FA25型高速分散均质机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司；Sorvall LYNX6000型高速落地冷冻离心机 美国Thermo Fisher公司；LGJ-18型冷冻干燥机 北京四环科学有限公司；722s型可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；RVA-Super4型快速粘度分析仪 瑞典波通仪器公司；TA.XT Express质构仪 英国Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 大米加速陈化储藏

参考张珅铖等[13]的方法，取适量‘金优207’和‘吉粳88’大米分别置于直径200 mm的无盖玻璃培养皿中，米粒厚度为10 mm，放入人工气候箱中加速陈化储藏，储藏条件为温度37 ℃、相对湿度85%，每周取样。

1.3.2 大米蛋白制备

将储藏不同时间的大米磨粉过80 目筛，按料液比1∶7（m/V）加入去离子水中，再用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0，在40 ℃、120 r/min下搅拌反应4 h，然后将悬浮液4 ℃、8 000 r/min离心20 min，取上清液用2 mol/L盐酸溶液调节pH值至4.0，静置20 min，在4 ℃、8 000 r/min下离心15 min得到蛋白沉淀，用去离子水洗涤3 次后，再将蛋白沉淀分散于4 倍体积的去离子水中，用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0，然后冷冻干燥得到大米蛋白。

1.3.3 大米蛋白羰基含量的测定

参考Huang Youru等[14]的方法，采用2,4-二硝基苯肼比色法在367 nm波长处测定吸光度，以22 000 L/（mol·cm）摩尔消光系数计算每毫克大米蛋白中羰基物质的量。

1.3.4 大米蛋白总巯基、游离巯基及二硫键含量测定

参考Beveridge等[15]的方法，采用Ellman’s试剂比色法在412 nm波长处测定吸光度，以13 600 L/（mol·cm）摩尔消光系数计算每毫克大米蛋白中总巯基和游离巯基物质的量，总巯基与游离巯基含量差值的1/2即为二硫键含量。

1.3.5 米粉糊化特性的测定

将储藏不同时间的大米磨粉过80 目筛，再依据GB/T 24852—2010《大米及米粉糊化特性测定 快速粘度仪法》[16]测定米粉糊化特性。

1.3.6 米饭质构特性测定

准确称取20 g大米，洗净后置于直径70 mm、高38 mm的加盖铝盒中，加入相当于米粒质量2倍的蒸馏水，浸泡20 min后沥干，然后加入相当于米粒质量1.4 倍的蒸馏水，盖上铝盒盖后蒸汽蒸煮20 min，再静置保温10 min，得到米饭。采用质构仪在TPA模式下测定米饭的硬度、黏着性、弹性、咀嚼性、黏聚性和回复性。测定模式：选用P/0.5圆柱塑料探头，测前速率1 mm/s，测试速率1 mm/s，测后速率10 mm/s；压缩程度10 mm；保持时间5 s；触发力5 g。

1.3.7 大米蒸煮食用品质感官评价

依据GB/T 15682—2008《粮油检验 稻谷、大米蒸煮食用品质感官评价方法》[17]进行大米蒸煮食用感官评价。首先参照附录A的“评价员挑选办法”，通过培训和鉴别实验挑选了10 名感官灵敏度高的人员作为评价员；然后，10 名评价员参照附录B的“米饭感官评价规则和记录表（评分方法一）”分别对不同储藏时间的2 个品种米饭的气味、外观结构、适口性、滋味和冷饭质地5 个指标进行感官评价，再根据每个评价员的综合评分结果计算平均值，计算结果取整数。每次品评，都会由10 名评价员共同选取1 份标准三等精度，综合评分75 分左右的新鲜大米作为参照样品。米饭感官评价标准见表1。

表1 米饭感官评价标准Table1 Criteria for sensory evaluation of cooked rice

1.4 数据处理

采用Excel 2003、SPSS 18.0软件对数据进行分析，除感官评分，其余结果均用平均值±标准差表示；采用Origin 7.5软件作图，采用Pearson双变量进行数据间的相关性分析，采用方差分析法进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 大米在储藏过程中蛋白氧化程度的变化

大米蛋白氨基酸分子中自由氨基和亚氨基极易受到活性氧攻击，经反应最终生成氨气和相应的羰基衍生物[18]。同时，L-半胱氨酸（L-cysteine，Cys）巯基是最容易被自由基攻击的氨基酸残基，巯基转变成二硫键或者其他物质是自由基引发的蛋白氧化过程中最早发现的变化之一[19-20]。因此羰基、总巯基、游离巯基和二硫键含量是目前最常用的衡量蛋白质氧化程度的指标。如表2所示，加速陈化过程中，‘金优207’和‘吉粳88’大米蛋白的羰基含量在1～4 周增加比较缓慢，4～12 周则显著增加，12 周以后增加幅度又趋于平缓。随着储藏时间延长，‘吉粳88’大米产生的羰基含量逐渐高于‘金优207’，表明这两种大米的蛋白氧化程度不断增加，且‘吉粳88’大米蛋白比‘金优207’更容易被氧化。两种大米蛋白的总巯基和游离巯基含量均呈下降趋势，且‘吉粳88’的下降趋势更为明显，也表明‘吉粳88’大米蛋白比‘金优207’更容易被氧化。‘金优207’大米蛋白二硫键含量无显著变化（P＞0.05），‘吉粳88’二硫键含量增加较明显，依据氧化环境和氧化强度的改变，蛋白质巯基的氧化可分为可逆氧化和不可逆氧化，可逆氧化主要是形成二硫键和次磺酸，不可逆氧化主要是形成亚磺酸和磺酸[21-22]；表明‘金优207’大米蛋白的游离巯基主要发生的是不可逆氧化反应，而‘吉粳88’既发生了可逆氧化也发生了不可逆氧化反应。

表2 储藏过程中大米蛋白羰基、总巯基、游离巯基和二硫键含量Table2 Protein carbonyl, total sulphydryl, free sulphydryl and disulf i de contents of rice protein during storage nmol/mg

2.2 蛋白质氧化程度对米粉糊化特性的影响

大米及其制品的糊化特性一直是反映其食用品质的重要指标之一。两种米粉的糊化特性参数如表3所示，储藏过程中两种米粉的峰值黏度均呈现先增后减的趋势，‘金优207’的峰值黏度在第5周时达到最大值（3 610 cP），‘吉粳88’的峰值黏度在第10周时达到最大值（4 210 cP）。Indudhara Swamy等[23]在研究糙米和精米储藏时也发现淀粉峰值黏度呈现先上升后下降的趋势。这两种米粉的最低黏度和衰减值随着储藏时间的延长没有统一的变化趋势，但最终黏度、回生值和糊化温度随储藏时间的延长均呈逐渐上升趋势。雷玲等[24]研究储藏过程中不同品种稻谷的品质变化时也发现最终黏度和回生值都增大。回生值是最终黏度与最低黏度的差值，可以反映米糊在冷却过程中的老化程度，回生值越大，表示米粉老化程度越大[25]。随着储藏时间的延长，‘吉粳88’的回生值增加程度要高于‘金优207’，这表明‘吉粳88’容易老化，不适于长期储藏。

表3 储藏过程中米粉的糊化特性Table3 Pasting properties of rice fl our during storage

Shibuya等[26]研究发现新鲜米粉和陈米粉的糊化特性有差别，但去除蛋白后的新鲜米淀粉和陈米淀粉却没有差异。Tan Yifang[27]、Zhu Lijia[28]等的研究也发现大米蛋白质含量不同是导致米粉与其对应的淀粉糊化特性差异的主要原因之一。Zhou Zhongkai等[29]研究发现高温（37 ℃）储藏的米粉经蛋白酶处理后，其峰值黏度和最终黏度发生了显著变化。这些研究从侧面反映了米粉糊化特性的变化主要是由大米的第二大组分蛋白质的组成和结构变化引起的。米粉糊化特征值与反映大米蛋白氧化程度指标的相关系数如表4所示，峰值黏度、最终黏度和回生值与大米蛋白羰基含量呈极显著正相关（P＜0.01），与总巯基和游离巯基含量呈极显著负相关（P＜0.01）。最低黏度与羰基、二硫键含量呈极显著正相关（P＜0.01），与总巯基含量呈极显著负相关（P＜0.01），与游离巯基含量呈显著负相关（P＜0.05）；这表明，米粉糊化特性与大米蛋白氧化程度密切相关，且随着蛋白质氧化程度的增加，米粉老化回生程度增加。

表1 米粉糊化特性与蛋白质氧化程度的相关系数Table1 Correlation coeff i cients between pasting properties and protein oxidation degree of rice fl our

2.3 蛋白质氧化程度对米饭质构特性的影响

如表5所示，随着储藏时间的延长，两种米饭的硬度均呈逐渐上升趋势，而咀嚼性、黏聚性、回复性、黏着性和弹性均呈下降趋势。‘金优207’的硬度、黏聚性和回复性大于‘吉粳88’，而黏着性小于‘吉粳88’，两者在咀嚼性和弹性方面差异不大。战旭梅[30]对‘汕优63’、‘武粳14’、‘扬8’等的加速陈化储藏研究中也发现质构特性发生了类似的变化趋势。

米饭质构特征值与大米蛋白氧化程度的相关系数如表6所示。米饭硬度与大米蛋白羰基含量和二硫键含量呈极显著正相关（P＜0.01），与总巯基、游离巯基含量呈极显著负相关（P＜0.01）。咀嚼性和弹性与大米蛋白羰基含量呈极显著负相关（P＜0.01），与总巯基含量和游离巯基含量呈极显著正相关（P＜0.01）；黏聚性、回复性与大米蛋白羰基含量和二硫键含量呈极显著负相关（P＜0.0 1），与总巯基含量呈极显著正相关（P＜0.01）；黏着性与大米蛋白羰基、二硫键含量呈极显著负相关（P＜0.01），与游离巯基含量呈极显著正相关（P＜0.01）。这表明大米蛋白中氨基和亚氨基的氧化，即羰基含量的增加，对米饭的硬度、咀嚼性、黏聚性、回复性、黏着性和弹性等质构特性均有负面影响，使米饭食味品质逐渐下降；Cys巯基的氧化，即游离巯基含量的下降，主要对硬度、咀嚼性、黏着性和弹性有极显著的影响；二硫键的形成主要对米饭的硬度、黏聚性、回复性和黏着性有影响。储藏过程中米饭质构特性变差的原因可能是，蛋白质氧化导致位于淀粉颗粒外周的大米蛋白交联度增加，抑制淀粉颗粒吸水膨润，致使淀粉不能充分糊化，此外加热时二硫键增多，蛋白质分子聚合为大分子，导致熟化食品质地变硬，咀嚼性、回复性、弹性等下降[31]。

表5 储藏过程中米饭的质构特性Table5 Texture properties of cooked rice during storage

表6 米饭质构特征值与蛋白质氧化程度的相关系数Table6 Correlation coeff i cients between texture properties and protein oxidation degree of cooked rice

2.4 蛋白质氧化程度对大米蒸煮食用品质感官评价的影响

表7 储藏过程中大米蒸煮食用品质感官评价得分Table7 Sensory evaluation of rice cooking and eating quality during storage

感官评价最能够直接反映人们对米饭蒸煮品质的优劣判断，两种米饭的感官评价结果如表7所示，随着储藏时间的延长，两种米饭的外观、气味、适口性、滋味和冷饭质地和综合评分均降低。储藏1～12周，‘吉粳88’的外观、适口性、滋味以及综合评分整体上高于‘金优207’，但储藏后期‘金优207’的各项指标则逐渐优于‘吉粳88’；这表明相比于‘金优207’，‘吉粳88’在储藏过程中感官品质劣变程度更大。

表8 大米蒸煮食用品质感官评价与蛋白质氧化程度的相关系数Table8 Correlation coeff i cients between sensory evaluation of cooking and eating quality and protein oxidation degree of rice

米饭感官评分与大米蛋白氧化程度的相关系数如表8所示。米饭的外观、气味、适口性、滋味、冷饭质地和综合评分均与大米蛋白羰基含量呈极显著负相关（P＜0.01），与总巯基含量和游离巯基含量呈极显著正相关（P＜0.01）；适口性和滋味与大米蛋白二硫键含量呈显著负相关（P＜0.05）。已有研究表明，米饭的感官品质和质构特性密切相关，如：米饭的硬度与感官评价指标均呈负相关，弹性与米饭的口感、形态和色泽呈正相关[32]，因而造成米饭质构特性下降的原因也可能是感官品质劣变的关键因素。稻谷储藏过程中，大米蛋白发生最为显著的氧化修饰是游离巯基转变为二硫键，一方面使大米蛋白交联度和聚集程度增加，影响淀粉膨润度和米饭质地；另一方面导致蒸煮米饭风味物中硫化物含量下降，影响米饭特有风味[33]。

3 结 论

‘金优207’和‘吉粳88’在加速陈化储藏过程中，大米蛋白羰基含量持续增加，总巯基和游离巯基含量逐渐下降，表明两种大米的蛋白氧化程度不断增加，且‘吉粳88’大米蛋白比‘金优207’更容易氧化。米粉糊化特性、米饭质构特性和感官品质均与大米蛋白氧化程度密切相关，主要表现在：米粉峰值黏度、最终黏度、回生值和米饭硬度与大米蛋白羰基含量呈极显著正相关（P＜0.01），与总巯基和游离巯基含量呈极显著负相关（P＜0.01）；米饭的咀嚼性、弹性、外观、气味、适口性、滋味、冷饭质地均与大米蛋白羰基含量呈极显著负相关（P＜0.01），与总巯基含量和游离巯基含量呈极显著正相关（P＜0.01）；米粉最低黏度、米饭硬度与大米蛋白二硫键含量呈极显著正相关（P＜0.01），而米饭黏聚性、回复性和黏着性等则与大米蛋白二硫键含量呈极显著负相关（P＜0.01）。这表明大米加速陈化储藏过程中，随着蛋白质氧化程度的增加，大米老化回生程度增加，米饭质构特性和感官品质明显下降。此外，通过对两种大米的蒸煮食用品质进行感官评价分析还可以看出，新收获的粳稻品种‘吉粳88’大米的各项指标均优于籼稻品种‘金优207’，但储藏后期，‘金优207’的各项指标则逐渐优于‘吉粳88’，这表明相比于‘金优207’，‘吉粳88’在储藏过程中感官品质劣变程度更大。