梅花果实品质及抑菌、抗氧化活性分析

刘玉霞，杨佳鑫，徐兴龙，李庆卫*

（花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室，国家花卉工程技术研究中心，城乡生态环境北京实验室，教育部林木花卉育种实验室，北京林业大学园林学院，北京 100083）

梅花（Prunus mume）属蔷薇科李属，是中国的传统名花，在我国有7 000多年的应用历史[1-2]和3 000多年的栽培历史[3]。梅按照用途可以分为观赏绿化用的花梅和加工食用的果梅，通常所说的梅花是指用来观赏的花梅。梅由最初以食用梅果为目的的引种栽培，经过长期的自然进化和人工定向选择培育，逐步发展到今天以观赏为目的花梅，最后演化为花果兼用梅[4]。陈俊愉曾明确提出：花果兼用梅是梅育种的重要领域，是梅花品种改良的五大目标之一[4]。随着观光农业、复合农业等的发展，花果兼用梅具有良好的应用前景。从果梅中筛选花期早、花型大、重瓣、花色艳丽的品种，或从花梅中筛选丰产、果大、质优的品种，是选育花果兼用梅的重要方式。

研究表明，梅果实具有抑菌[5-7]、抗氧化[8-11]、抗骨质疏松[9]、抗癌[12]、美白皮肤[13]等作用。目前，对梅果实的基本品质及功能研究主要集中在青梅和果梅上[6,14]，对花梅（即梅花）果实品质性状少有研究。随着抗寒梅花育种成功，梅花逐渐应用在北方园林中，而果梅栽培长期以来一直处于南方地区[4]，在北方地区的应用较少，因此选育能在北方地区推广的抗寒花果兼用梅具有一定意义。本研究通过测定北京地区栽培的8 个梅花品种（取样时选取有一定抗寒性、花朵观赏性强、果实产量较高的品种）果实的品质性状、抑菌和抗氧化活性，对酚类化合物进行分离和检测，利用生物统计学方法进行差异比较和相关性分析，对观赏类抗寒梅花的果实品质进行评价，以期为抗寒花果兼用梅的选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘美人梅’、‘丰后’、‘武藏野’、‘江北朱砂’、‘鹫峰丰后’、‘淡丰后’、‘粉靥丰后’、‘飞绿萼’8 个品种梅花的果实（8～9 成熟）于2016年7月取自北京林业大学鹫峰实验林场（北纬40°3′，东经116°5′）。

枯草芽孢杆菌（ATCC6633）、副溶血性弧菌（ATCC17802）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）上海鲁微科技有限公司；葡萄糖、芦丁、没食子酸、水溶性VE（Trolox） 合肥博美生物科技有限责任公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PB-10型pH计 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HY211212型手持折光仪 北京云华科仪科技有限公司；NF555便携式分光色差仪 日本电色工业株式会社；BIOMATE 3S紫外分光光度计 北京博宇宝威实验设备公司；高效液相色谱质谱联用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）仪美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 外观品质指标测定

随机选取5 枚鲜果，用电子天平称质量，取其平均值，重复4 次。将鲜果去掉果肉，用电子天平称果核的质量，取其平均值，重复4 次。亮度（L*）、红绿度（a*）、黄蓝度（b*）采用色差仪测定。可食率按式（1）计算。

用游标卡尺测定果实纵径和横径，果形指数按式（2）计算。

1.3.2 食用品质指标测定

总酸质量分数（以柠檬酸计）、pH值的测定采用pH计的电位滴定法[15]；可溶性糖质量分数的测定采用蒽酮比色法[15]；水分质量分数的测定采用直接干燥法[15]；VC含量的测定采用2,4-二硝基苯肼法[15]；可溶性固形物质量分数的测定采用折光仪法[15]；总酚含量的测定采用福林-酚法[7]；总黄酮含量的测定采用亚硝酸盐-氯化铝法[16]。糖酸比按式（3）计算。

1.3.3 HPLC-MS鉴定酚类化合物成分

HPLC条件[17]：流动相A：甲醇；流动相B：0.1%甲酸溶液；体积比40∶60；流速：0.55 mL/min。MS条件：电喷雾（electron spray ionization，ESI）离子源；正离子和负离子模式检测；鞘气（N2）流速：250 L/h；辅助气（N2）流速：50 L/h；电压：3.0 kV；毛细管温度：350 ℃；毛细管电压：30 V。

1.3.4 抑菌活性测定

1.3.4.1 梅花果实纯汁制备

将梅花果实去皮、去核，切碎、研磨，用4 层纱布挤出滤液，4 000 r/min离心10 min，取上清液。

1.3.4.2 菌悬浮液制备

利用平板划线法将菌株接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在37 ℃下培养24 h。挑取单个菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基内，在37 ℃下摇动培养至所需浓度。无菌操作下将细菌浓度调至0.5麦氏比浊单位，用于后续实验。

1.3.4.3 滤纸片扩散法测定抑菌圈直径

将20 mL熔融的水解酪蛋白琼脂培养基倒入直径90 mm培养皿中，凝固后取200 μL菌液均匀涂布在培养基表面，待培养基风干，等距离放入直径6 mm无菌滤纸片。用微量移液器吸取10 μL浸提液至滤纸片上。37 ℃培养18 h，每个样品重复3 次，十字交叉法测定抑菌圈直径。

1.3.5 抗氧化活性的测定

1.3.5.1 样品制备

各样品分别称取3.00 g左右，以料液比1∶10加入90%乙醇溶液，于90 ℃水浴中加热2 h，4 000 r/min离心10 min，滤纸过滤后滤液装入棕色瓶中4 ℃保存备用。

1.3.5.2 DPPH自由基清除能力的测定

参考Mezadri等[18]的方法稍做调整。准确称取5 mg 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）溶解于100 mL无水乙醇中，置于棕色瓶中，在4 ℃避光保存，制成DPPH工作液。吸取待测样品0.5 mL，加入2.5 mL DPPH工作液，漩涡振荡混匀，避光37 ℃水浴30 min，在517 nm波长处测吸光度。以Trolox作为对照。按照公式（4）计算DPPH自由基清除率。

式中：Ai为加入0.5 mL样品溶液和2.5 mL DPPH工作液的吸光度；Aj为加入0.5 mL样品溶液和2.5 mL无水乙醇的吸光度；A0为加入0.5 mL乙醇和2.5 mL DPPH工作液的吸光度。

1.3.5.3 总抗氧化能力的测定

方法参考Rvanden等[19]的方法稍做调整，采用2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基清除实验测定样品的总抗氧化能力。ABTS工作液配制：10 mL 0.22 mmo1/L ABTS溶液和10 mL 0.2623 mmol/L过硫酸钾溶液混合，避光过夜。使用时用pH 7.4磷酸盐缓冲液稀释40 倍。取20 μL样液加入体积分数90%乙醇溶液定容至100 μL，加入2.5 mL ABTS工作液，漩涡振荡混匀，避光37 ℃水浴30 min，在746 nm波长处测吸光度。以Trolox作为对照。按照公式（5）计算ABTS＋·清除率。

式中：Ai为加入0.1 mL样品溶液和2.5 mL ABTS工作液的吸光度；Aj为加入0.1 mL样品溶液和2.5 mL磷酸盐缓冲液的吸光度；A0为加入0.5 mL乙醇溶液和2.5 mL ABTS工作液的吸光度。

1.3.5.4 亚硝酸盐清除能力的测定

参考薛长晖等[20]的方法稍作调整。取2 mL样品溶液于25 mL容量瓶中，加入0.005 mg/mL亚硝酸钠标准溶液3 mL和pH 3.0磷酸-柠檬酸缓冲液5 mL，37 ℃下反应30 min，立即加入2 mL质量分数0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min后加入1 mL质量分数0.2%盐酸萘乙二胺溶液，加蒸馏水定容至刻度，混匀，静置15 min，在544 nm波长处测定吸光度。以Trolox作为对照。按照公式（6）计算亚硝酸盐清除率。

式中：Ai为加入2 mL样品溶液时反应溶液的吸光度；Aj为仅加入2 mL样品溶液不加反应液时的吸光度；A0为不加样品溶液时反应液的吸光度。

1.3.5.5 还原能力的测定

还原能力的测定采用铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）法，参考B e n z i e等[21]的方法稍作调整。F R A P工作液由0.3 m o l/L醋酸盐缓冲液25 m L、10 mmol/L三吡啶基三嗪溶液2.5 mL和20 mmol/L FeCl3溶液2.5 mL组成。取0.5 mL待测样品溶液，加入2.5 mL FRAP工作液混匀后37 ℃反应30 min，在593 nm波长处测定吸光度。以Trolox作为对照，利用标准曲线法计算还原能力。

铁还原能力的测定参考Venkatachalam等[22]的方法稍作调整。0.1 mL样品溶液中分别加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液0.5 mL、质量分数1%铁氰化钾溶液0.5 mL混合均匀，50 ℃水浴下保温20 min，再加入质量分数10%三氯乙酸溶液0.5 mL，振荡混匀后离心。取离心后的上清液0.8 mL，加入0.8 mL去离子水和0.16 mL质量分数0.1%氯化铁溶液，振荡混匀后在50 ℃水浴下保温10 min，在700 nm波长处测定吸光度。以Trolox作为对照，利用标准曲线法计算铁还原能力。

1.3.5.6 梅花果实等级评价

根据房经贵等[14]对果梅的分类标准，从鲜果质量、可食率、可溶性固形物、总酸量、果核质量5 个方面对8 个品种梅花果实进行等级评价。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2013软件建立数据库，用SPSS 13.0软件进行相关性分析和方差分析及最小显著性差异法（least significant difference，LSD）多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同品种梅花果实外观品质指标分析

不同的梅加工制品对果实大小有着不同的要求[14]，由表1可知，‘武藏野’、‘粉靥丰后’鲜果质量显著高于其他品种，分别为33.76 g和33.58 g；‘飞绿萼’鲜果质量最小，为6.50 g。各果实可食率范围在87.18%～94.59%之间，其中‘美人梅’可食率最高，‘飞绿萼’最低。可食率决定了梅果实的加工利用率，因此是影响梅加工品质量的重要因子之一，一般要求果实的可食率在85%以上，且越高越好[14]。从果形指数来看，多个品种之间果形指数差异不明显，整体范围在0.94～1.04之间。L*值代表明暗度，‘淡丰后’和‘飞绿萼’L*值较高，‘美人梅’L*值最低。a*值代表红绿度，‘美人梅’、‘鹫峰丰后’、‘粉靥丰后’、‘淡丰后’a*值为正，颜色偏红或者有部分红色，‘美人梅’a*值显著大于其他品种；b*值代表黄蓝度，8 个品种的b*值均为正，颜色都偏黄或有部分黄色，‘飞绿萼’、‘鹫峰丰后’、‘淡丰后’b*值显著大于其他品种。

表1 不同品种梅花果实外观品质指标Table1 Appearance and quality characteristics of fruits of Prunus mume

2.2 不同品种梅花果实食用品质指标分析

如表2所示，不同品种梅花果实水分质量分数在84.88%～91.89%之间，其中‘江北朱砂’水分质量分数显著高于其他品种。可溶性固形物质量分数在5.93%～12.62%之间，其中‘美人梅’显著高于其他品种，‘丰后’、‘江北朱砂’显著低于其他品种。可溶性糖质量分数在1.96%～5.73%之间，‘粉靥丰后’可溶性糖质量分数最高，‘江北朱砂’最低。总酸质量分数在2.49%～8.62%之间，‘飞绿萼’总酸质量分数最高，‘粉靥丰后’最低。糖酸比范围在0.32～2.30之间。梅果实是典型的低糖高酸型果实，但本研究中‘美人梅’、‘粉靥丰后’可溶性糖质量分数高于总酸质量分数。pH值范围在2.83～3.20之间，其中‘粉靥丰后’的pH值最大。VC含量在6.00～48.63 mg/100 g之间，其中‘丰后’、‘飞绿萼’、‘江北朱砂’VC含量显著大于其他5 个品种。总酚含量在43.50～363.21 mg/100 g之间，总黄酮含量在45.48～285.40 mg/100 g之间，其中‘武藏野’、‘丰后’、‘飞绿萼’总酚和总黄酮含量显著高于其他品种，其次为‘美人梅’，‘江北朱砂’、‘粉靥丰后’、‘鹫峰丰后’、‘淡丰后’之间无显著性差异。

2.3 酚类化合物鉴定分析结果

对总酚含量最高的3 个品种‘丰后’、‘武藏野’、‘飞绿萼’的酚类物质进行分析（表3）。从3 个品种中共鉴定出21 种酚类化合物，其中‘丰后’中鉴定出17 种，‘武藏野’中鉴定出16 种，‘飞绿萼’中鉴定出10 种。3 个品种都分离出儿茶素、迷迭香酸、圣草酚、丁香酸和芦丁5 种化合物，其HPLC图谱如图1所示。

表3 HPLC-MS鉴定酚类化合物结果Table3 Identi fi cation of phenolic compounds by HPLC-MS

表2 不同品种梅花果实食用品质指标Table2 Eating quality characteristics of fruits of Prunus mume

图1 5 种酚类化合物HPLC图谱Fig.1 HPLC prof i les of5 phenolic compounds

2.4 不同品种梅花果实的抑菌活性分析

表1 不同品种梅花果实对3 种菌株的抑菌活性Table1 Antimicrobial activity against three strains of different cultivars

如表4所示，8 个品种梅花果实纯汁对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径在7.17～9.00 mm之间，‘江北朱砂’、‘飞绿萼’、‘丰后’、‘武藏野’果实纯汁的抑菌作用显著大于‘粉靥丰后’；对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在6.00（无抑菌作用）～16.67 mm之间，其中‘飞绿萼’抑菌作用最强，‘粉靥丰后’、‘鹫峰丰后’、‘美人梅’没有抑菌作用；对副溶血性弧菌的抑菌圈直径在7.83～17.33 mm之间，其中‘丰后’的抑菌作用最强。

2.5 不同品种梅花果实的抗氧化活性分析

表5 不同品种梅花果实的抗氧化活性Table5 Antioxidant activity of different cultivars

如表5所示，从DPPH自由基清除能力来看，‘飞绿萼’、‘武藏野’、‘丰后’、‘江北朱砂’显著高于其他4 个品种。从还原能力（FRAP）来看，‘丰后’和‘武藏野’显著高于其他品种。从亚硝酸盐清除能力来看，‘丰后’和‘武藏野’最强，其次是‘飞绿萼’，其他5 个品种间无显著性差异。从铁还原能力和总抗氧化能力来看，排序前3 位的品种依次为‘武藏野’、‘丰后’、‘飞绿萼’。从5 个抗氧化指标综合来看，‘武藏野’、‘丰后’、‘飞绿萼’抗氧化活性较强。

2.6 相关性分析

由表6可知，不同品种梅花果实对枯草芽孢杆菌的抑制作用与糖酸比呈极显著负相关；与总酚、总黄酮含量、总酸质量分数相关性不显著。不同品种梅花果实对金黄色葡萄球菌的抑制作用与总酸质量分数呈极显著正相关；与总酚、总黄酮含量、糖酸比相关性不显著。不同品种梅花果实对副溶血性弧菌的抑制作用与总酚、总黄酮含量呈显著正相关；与总酸质量分数和糖酸比相关性不显著。不同品种梅花果实对不同菌株的抑菌活性间相关性不显著。

表6 不同品种梅花果实食用品质指标与抑菌活性的相关性分析Table6 Correlation analysis between antimicrobial activity and quality characteristics in different cultivars

表7 不同品种梅花果实食用品质指标与抗氧化能力的相关性分析Table7 Correlation analysis of antioxidant activity and the quality characteristics in different cultivars

如表7所示，DPPH自由基清除能力与总酚、总黄酮、VC含量相关性不显著。还原能力（FRAP）和总抗氧化能力与总酚含量呈极显著性正相关，与总黄酮含量呈显著正相关，与VC含量相关性不显著。亚硝酸盐清除能力和铁还原能力与总酚和总黄酮含量呈极显著性正相关，与VC含量相关性不显著。5 个评价指标中，还原能力（FRAP）、亚硝酸盐清除能力、铁还原能力、总抗氧化能力之间存在显著或极显著正相关，而DPPH自由基清除能力仅与铁还原能力存在显著性正相关。

2.7 梅花果实等级评价

从鲜果质量来看：‘飞绿萼’、‘鹫峰丰后’为1级；‘丰后’、‘江北朱砂’为2级；‘美人梅’为5级；‘淡丰后’为7级；‘粉靥丰后’、‘武藏野’为9级。从可溶性固形物质量分数来看：‘丰后’、‘江北朱砂’为3级；‘武藏野’为5级；‘鹫峰丰后’、‘淡丰后’、‘粉靥丰后’、‘飞绿萼’为7级；‘美人梅’为9级。从总酸质量分数来看：‘粉靥丰后’为1级；‘美人梅’、‘鹫峰丰后’为3级；‘武藏野’、‘江北朱砂’为5级；‘丰后’、‘淡丰后’为7级；‘飞绿萼’为8级。从可食率来看：‘丰后’、‘飞绿萼’为5级；其他品种为7级。从果核质量来看：‘美人梅’、‘江北朱砂’、‘鹫峰丰后’、‘飞绿萼’为1级；‘丰后’为3级；‘粉靥丰后’为5级；‘武藏野’和‘淡丰后’为7级。

3 讨 论

从果梅分类标准来看，‘淡丰后’评价等级最高，5 个指标均为7级；‘粉靥丰后’、‘武藏野’、‘飞绿萼’有3 个指标为7级及以上，故可以从‘淡丰后’、‘粉靥丰后’、‘武藏野’及‘飞绿萼’中选育抗寒花果兼用梅。

除基本品质外，总酚、总黄酮等功能性成分含量也是影响果实品质评价的重要指标。本研究结果表明，总酚、总黄酮含量与梅果实抑菌和抗氧化活性均具有相关性，这与Xia Daozong[7]、Pan[8]等的研究结果一致。本研究中‘丰后’、‘武藏野’、‘飞绿萼’总酚和总黄酮含量最高，从3 个品种中共鉴定出21 种酚类化合物，且都分离出儿茶素、迷迭香酸、圣草酚、丁香酸、芦丁5 种酚类化合物。研究表明，儿茶素具有抗炎、抗菌、抗病毒及抗氧化等作用[23-24]，迷迭香酸具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫调节等作用[25-26]，圣草酚可以通过清除自由基而抑制自由基诱导的生物大分子损伤，同时可以显著抑制肝癌细胞的活性[27]，芦丁具有抗菌消炎、抗辐射、止血和抗氧化等作用[28-30]，丁香酸具有抗内毒素作用[31]。故‘丰后’、‘武藏野’、‘飞绿萼’可以作为天然抗氧化剂或者功能性食品进行开发利用。综上，‘武藏野’和‘飞绿萼’果实品质性状较优。本研究为梅花果实品质评价及抗寒花果兼用梅选育提供依据，为梅花果实的综合利用和生产天然抗氧化剂以及功能性食品的开发提供参考。