采用改良(1,3)-β-D-葡聚糖检测法监测某部中心医院侵袭性毛孢子菌感染情况

祝 贺，敖俊红，杨蓉娅

毛孢子菌广泛存在于部队日常野外训练接触到的土壤、水源及腐败植物中，实际感染率并不低。传统的诊断方法主要是皮损、血浆、痰、脑脊液或内脏组织培养。其中，血培养对侵袭性真菌感染的诊断尤为常用，但检出率较低，漏诊几率较高。毛孢子菌感染的筛查在临床中特别是在重症监护病房（ICU）、导管室等感染高发部门还没有普遍开展。

(1,3)-β-D-葡聚糖（BG）是真菌细胞壁主要组成成分，只有当真菌被吞噬、细胞壁被破坏后才释放到血液和其他体液中。临床上检测BG的实验称为G试验，主要用于诊断侵袭性念珠菌和曲霉感染，对真菌感染的排查具有非常重要的价值[1]。但传统G试验需要反复大量采集血液标本，不适用于野外作训环境；且由于技术条件限制和外界热源的干扰，误诊和漏诊率较高，需要操作技术的改良和更多标本类型的补充替代。本研究旨在运用改良后的G试验与分子生物学方法对照并结合，以提高毛孢子菌的临床检出率，找到可代替传统标本的采集法。

1 材料与方法

1.1 标本采集

收集从2014年10月—2017年10月，北方某部中心医院现有ICU病房中来自基层作训部队送诊的不明原因发热和系统衰竭患者和其他来源的ICU或NICU病房内所有毛孢子菌易感染人群，如长期卧床使用呼吸机、留置导尿管、移植及植入术后不明原因高热、急性呼吸窘迫综合征、慢性支气管扩张并发感染，小儿难治性肺炎和持续性发热等患者共计154例，其中军队人员56例，其他人员98例。排除标准：2周内进行血透者；静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或其他血液制品者；细菌菌血症者；使用多糖类抗癌药物、放化疗药物者；1周内食用菌类食物者。所有患者于入院后第1周、第2周时分别采集血浆1 ml、尿液5 ml；急性呼吸窘迫综合征、慢性支气管扩张并发感染、小儿难治性肺炎患者，于入院第1周和2周时采集支气管肺泡灌洗液20 ml。训练开放伤后送人员在入院后1周内采集伤口分泌物。所有患者均签署知情同意，并通过伦理委员会审核。

1.2 试剂与仪器

GlucatellTM试剂盒（美国CAPE公司），MK3自动酶联测定仪（美国Thermo公司）。DNA提取用Fast DNA®SPIN试剂盒（MP Bio公司）。PCR扩增用TaKaRa Taq™聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶及100 bp Ladder均购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。API 21AUX生化鉴定试剂盒（法国梅里埃公司）。外置游离加热器（装置由西安交通大学机械学院研制）。全部玻璃器皿及不锈钢镊子经235℃干烤7 h去除热原；塑料制品经3%双氧水浸泡4 h后37℃干燥。

1.3 形态学观察与菌种鉴定

将所有标本分别点种于沙堡弱琼脂培养基（SDA，葡萄糖浓度为4%，不加放线菌酮），22℃培养10 d。10 d后有淡黄色、表面脑回样皱褶的干酪样菌落生长，玻片小培养镜下可见矩形关节孢子，API 21AUX生化鉴定为毛孢子菌属者为阳性，不能同时满足上述条件者为阴性。

1.4 BG测定

各标本等量分置于两组灭热源的EP管中，分为实验A组和实验B组。根据G试验原理，按GlucatellTM试剂盒操作说明进行。实验A组：将血液、支气管肺泡灌洗液、尿液标本，分别通过外置游离加热器均匀预热处理（160℃，3 h）后，各取100 μl，放入96孔微孔板中，加入主要反应试剂G因子50 μl，于37℃加热板上孵育30 min。 加入终止反应的重氮偶联试剂，混匀后在540 nm波长滤光片下测定其OD值并自动换算BG浓度值，每次均同时做空白及设阳性对照。实验B组除不进行外置游离加热器预处理外，所有实验步骤与A组相同。精密度试验：将同一标本在同一时间用同批号试剂重复测定25次；将同一份标本在不同时间试验中分别测定25次。结果判断：血浆BG浓度＞20 pg/ml为阳性，否则为阴性。

1.5 巢式聚合酶链反应（PCR）

血浆、支气管肺泡灌洗液及尿液各100 μl按试剂盒提示步骤提取DNA。引物设计：ITS1:5'-TCCGTAGGTGAAC-3'，ITS4:5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3'。巢式PCR扩增总反应体积为50 μl，94℃预变性 3 min，94℃ 30 s，57℃ 1 min，72℃1 min，30个循环，72℃延伸10 min；取1 μl首次扩增产物作模板，加入第二对引物及相关反应试剂，经94℃预变性 3 min，94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 40 s，30个循环，72℃延伸10 min。第2次PCR扩增产物10 μl在1.2%琼脂糖凝胶电泳。质量控制：每次PCR扩增分别设立阳性及阴性对照。阳性对照应用β-肌动蛋白；阴性对照用无菌蒸馏水。DNA序列分析：用玻璃奶DNA回收试剂盒对凝胶中的DNA进行回收，并经ABI377核苷酸测序仪检测。

2 结果

2.1 毛孢子菌检出情况

共检测出不同种类毛孢子菌43株。所有菌株ITS区均可扩增出539-540 bp的片段，各菌株的酶切图谱基本一致。其中支气管肺泡灌洗液15株，血液10株，尿液3，其余15株均来源于野外训练伤开放性伤口分泌物，由于为皮肤浅表感染，不列入本文G试验与巢式PCR检测统计数据。

2.2 传统G试验与改良G试验比较

对比实验A、B两组不同检测方法的敏感性及特异性，结果显示A组与B组相比，敏感性和特异性均有提升，其中敏感性和准确度的提高有统计学意义（P＜0.05），而假阳性和假阴性率均下降（表1）。入院1周后毛孢子菌感染患者的血浆、支气管肺泡灌洗液和尿液的BG检测阳性率较入院2周时高（P＜ 0.05）（表 2）。

2.3 入院1周毛孢子菌感染患者3种体液标本及检测方法敏感性与特异性比较

在血浆和支气管肺泡灌洗液中改良G试验敏感性高于巢式PCR扩增，差异有统计学意义（P＜0.05），而巢式PCR的特异性优于改良G试验（表3）。

表1 两组的敏感性与特异性比较

表2 毛孢子菌感染患者不同入院时间的体液标本阳性率比较 （%）

表3 入院1周毛孢子菌感染患者不同标本及检测方法敏感性与特异性的比较

3 讨论

侵袭性真菌感染是增加免疫缺陷患者病死率的重要因素之一，因此早期诊断就显得尤为重要。传统的诊断需要对相关组织进行培养和组织病理学检查，而血液培养仍然是诊断的金标准。培养物需要1周以上的生长期与鉴定期，对于侵袭性真菌感染患者来说，这种诊断延迟是致命的[2]。

BG水平对于侵袭性真菌感染具有早期预警和反应感染转归的重要意义，尤其是在尚未出现感染症状时，对BG水平进行连续监测，可以更好地预防和控制感染的发生、发展[3]。但有研究显示，传统G试验在某些患者中存在较高的假阳性率，如革兰阴性细菌感染者[4]，这通常是由于标本内革兰阴性细菌内毒素（LTP）的干扰。该成分是革兰阴性细菌外膜的组分，一般的高压灭菌不能使其灭活。因此，笔者在实验前对标本进行了160℃、3 h的改良设备预处理，以灭活细菌内毒素这一干扰热原。由于160℃仅对BG有解螺旋作用，冷却后，螺旋结构复性，不影响G试验数值的读取，从而提高了G试验的敏感性和特异性，降低了假阳性率[5]。同时笔者在人群的筛选上，将肿瘤化疗人群进行了剔除，主要原因是这部分患者可能具有多种真菌和细菌在腔道的定植，影响检测结果的准确性[6]。

BG水平虽然可以提示有无真菌的感染，甚至评价感染的转归，但不能确定真菌种类，临床上往往只能先经验性用药，并等待培养与药敏结果。笔者选择联合分子生物学巢式PCR扩增以提高毛孢子菌的检出率和检测特异性。研究发现毛孢子菌特异性片段巢式PCR扩增与BG检测在敏感性上相差不大，但由于PCR扩增的目标是真菌的核酸片断，需要有完整菌体的支持，因此在含有大量吞噬细胞的血浆和支气管肺泡灌洗液中敏感性较改良G试验略低。

两种检测方法均显示支气管肺泡灌洗液与血浆有着相似的敏感性和特异性，其中改良G试验在支气管肺泡灌洗液中的敏感性在入院1周时更优于巢式PCR，且避免了传统检测需要反复采血的问题。对于经呼吸道感染的毛孢子菌病患者的早期筛查具有良好的应用前景。而巢式PCR的高特异性又弥补了G试验做为非特异性试验的不足，二者相结合，可以提高毛孢子菌感染的检出率、缩短检出时间。本研究中，尿液中虽然也检测出BG和特异性DNA片段，但阳性率均较低，且是否与卧床患者的泌尿系真菌的定植相关，还有待进一步分析。研究发现，改良G试验对入院1周的标本的敏感性较入院2周时高，分析原因可能与急性感染早期大量吞噬细胞、吞噬真菌，释放BG进入体液有关；2周后，经过抗真菌药物的应用，总载菌量减少，因而检出率有所下降，提示改良G试验更适用于感染早期的诊断。