TOMM40基因rs2075650位点多态性与脑梗死的关系

焦雪倩，余丹，黄伏生

（武汉大学中南医院 检验科，湖北 武汉 430071）

脑卒中是遗传和环境共同作用的疾病，具有高发病率和高病死率，其中梗死性脑卒中是最常见的形式，约占全部脑卒中的80%[1]。据报道，高血压、糖尿病及高血脂等是脑梗死的危险因素[2]。此外，一些未知的基因也与脑梗死的发生有关。线粒体外膜转移酶 40（translocase of outer mitochondrial membrane 40,TOMM40）定位于19q13.2，在某些蛋白质如DNA聚合酶、RNA聚合酶及氧自由基清除因子等进入线粒体的过程中起作用[3]。本研究采用高分辨率熔解曲线（high resolution melting, HRM）技术，探索TOMM40基因多态性与武汉地区中老年人群脑梗死发病的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年9月—2017年7月在武汉大学中南医院就诊的507例汉族脑梗死患者作为脑梗死组。其中，男性305例，女性202例；年龄40～84岁，平均（66.89±11.68）岁；所有患者经过CT或MRI证实。纳入标准：无脑梗死病史，经CT或MRI检查无脑血管病变。排除标准：脑出血、颅内占位、自身免疫性疾病、严重的肝肾疾病、感染性疾病及恶性肿瘤。收集同期在武汉大学中南医院体检中心就诊的510例汉族健康体检者作为对照组。其中，男性313例，女性197例；年龄42～87岁，平均（65.62±11.77）岁；收集受试者的性别、年龄、收缩压（systolic blood pressure, SBP）、舒张压（diastolic blood pressure, DBP）、血糖（blood glucose, GLU）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、三酰甘油（Triglyceride, TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）及低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）。本研究通过本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA的提取 收集受试者的静脉血2 ml，用苯酚-氯仿法提取基因组DNA，纯度和浓度采用Nanodrop 2000C分光光度计（美国Thermo Fisher公司）检测。

1.2.2 目的片段的扩增及基因型的检测TOMM40基因rs2075650位点正向引物：5’-AGGAAGAGAT GAGAGTTGGTGTG-3’，反向引物：5’-CTGGAGAA GAGAAACGCTGTC-3’。PCR反应体系为10μl。PCR反应结束后使用LightScanner 96高分辨率分析系统（美国Idaho Technology公司）结合熔解曲线进行基因分型。根据熔解曲线图挑选出不同基因型的样本进行PCR扩增，扩增产物送到武汉天一辉远生物公司进行测序验证。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 选取脑梗死组和对照组患者各80例，收集静脉血2 ml，取200μl血用DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取DNA，剩余血液用Trizol（美国Invitrogen公司）试剂提取RNA，纯度和浓度用Nanodrop 2000C分光光度计（美国Thermo Fisher公司）检测，将提取的RNA置于-80℃冰箱保存。利用逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司）将RNA逆转录为cDNA。TOMM40基因正向引物：5’-CATCCAGACCCAGCAGTCG-3’，反向引物：5’-GAGGTAGTGGGCTACGAGGA-3’，选 取 3- 磷酸甘油醛脱氢酶为内参基因。内参基因正向引物：5’-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’，反向引物：5’-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3’。总反应体系为20μl。qRT-PCR反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。每个样本重复检测2次，取2次检测的平均值。用2-ΔCt法计算相对表达量。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计学软件，计量资料以均数±标准差（±s）或中位数和四分位数间距M（P25，P75）表示，比较用t检验或秩和检验，计数资料以率（%）或构成比表示，比较用χ2检验，群体基因型用Hardy-Weinberg遗传平衡检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组年龄、性别及LDL-C比较，差异无统计学 意 义（P＞0.05）；两 组 SBP、DBP、GLU、TC及TG、HDL-C比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 两组基因型和等位基因的频率比较

两组TOMM40基因rs2075650位点AA、AG及GG基因型频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），两组A、G等位基因频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。脑梗死组显性模型AA与AG+GG基因型频率分别占83.63%和16.37%，对照组分别为77.84%和22.16%，两组AA与AG+GG基因型频率比较，差异有统计学意义0.942）P=0.019]，脑梗死组隐性模型GG与AG+AA基因型频率分别占1.18%和98.82%，对照组分别为2.55%和97.45%，两组GG与AG+AA基因型频率比较，差异无统计学意义。见表2和附图。

表1 两组一般资料比较

表2 两组患者基因型和等位基因频率比较 例（%）

附图 HRM对TOMM40基因rs2075650位点的分型图

2.3 两组TOMM40 mRNA表达水平比较

脑梗死组TOMM40mRNA表达量为3.91（1.71，6.49），对照组为7.84（6.24，10.18），经秩和检验，差异有统计学意义（Z=-6.834，P=0.000），脑梗死组低于对照组。

3 讨论

TOMM40基因位于19q13.2，是外膜转位酶形成的复合体，介导核基因编码的蛋白质从细胞质进入线粒体的传递。TOMM40位于载脂蛋白E（apolipoprotein E,APOE）上游，其中的几个单核苷酸多态性与APOE具有连锁不平衡[4-5]。TOMM40与阿尔茨海默病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、长寿及认知障碍等有关[6-8]。APOE可能与TOMM40相互作用而影响线粒体功能[9]。线粒体被认为是所有细胞的动力，在中枢神经系统中发挥重要作用，为神经元的存活提供能量[10]。线粒体中99%蛋白质都是由核基因编码合成再转运到线粒体中，而TOMM40几乎为所有核编码的线粒体蛋白质入口的重要组成部分，TOMM40的减少或功能障碍导致一些重要的蛋白质不能进入线粒体发挥作用，影响线粒体的功能和神经元的存活[11]。HAINES等[12]发现敲除小鼠的解偶联蛋白2（uncoupling protein 2,UCP2）基因能使缺血再灌注小鼠脑组织的梗死面积增加，敲除UCP2后能抑制缺血再灌注后的抗氧化基因。UCP2能够保护血管内皮细胞，改善脑血管功能障碍[13-14]。UCP2的表达下调还与动脉粥样硬化、血管损伤有关，影响神经传递，对神经系统疾病的发生有重要影响[15]。解偶联蛋白属于线粒体载体蛋白超家族，TOMM40的缺乏可能影响解偶联蛋白转运到线粒体发挥作用，从而引起线粒体功能障碍，影响脑组织的功能。

本研究中脑梗死组与对照组TOMM40基因的rs2075650位点之间基因型和等位基因的频率分布比较有差异，对照组中突变等位基因G的频率高于脑梗死组，脑梗死组和对照组的显性模型（AA vs AG+GG）基因型频率也有差异，说明该基因位点可能与脑梗死的发病相关。YAMASE等[16]发现TOMM40的rs2075650位点与脑梗死有相关性，且次要等位基因G是脑梗死的保护性基因，与本研究结果一致。对相关指标的分析表明，血压、GLU及TG是脑梗死发病的危险因素，HDL-C可能是脑梗死的保护性指标，这符合传统的研究结果。然而本研究中两组LDL-C比较无差异，可能是脑梗死患者所用药物及人群选择差异导致。qRT-PCR结果显示，对照组的TOMM40 mRNA相对表达量高于脑梗死组。机制可能是脑梗死患者TOMM40 mRNA表达量下调影响核基因编码的蛋白质进入线粒体，导致一些关键性蛋白质不能发挥作用，线粒体的功能障碍、脑组织能量不足等可能导致脑梗死的发生。LEE等[17]发现TOMM40 mRNA在阿尔茨海默病患者中表达下调，该疾病的发生可能也与TOMM40相关蛋白质无法正常发挥作用有关。

综上所述，本研究用HRM技术对脑梗死组和对照组TOMM40的rs2075650位点进行基因分型，并用qRT-PCR检测基因的相对表达量，发现武汉地区中老年汉族人群中该基因位点与脑梗死的发病相关。