氧化苦参碱改善病毒性心肌炎小鼠心室重构的作用研究*

王勇胜，潘银凤，吕瑞峰，崔山龙，陈少宏

（1.山东省莘县第二人民医院，山东 莘县 252423；2.长春中医药大学，吉林 长春130117；3.广西中医药大学，广西 南宁 530200）

病毒性心肌炎常见于儿童及青壮年，其引发的心力衰竭（以下简称心衰）是发生不良事件的重要原因之一[1]。在心衰的过程中，失衡的心肌细胞能量代谢是其进展的关键因素。骨膜蛋白与钙联蛋白心室重构、心衰后疾病转归关系密切[2-3]。目前，氧化苦参碱通过多条信号通路改善心衰患者的心功能，抑制心室重构，已成为研究热点[4-5]。本研究采用柯萨奇B3病毒（CVB3）感染BALB/c小鼠复制病毒性心肌炎心衰模型，观察氧化苦参碱对心衰小鼠心肌能量代谢、心室重构、细胞凋亡的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein,GRP78）、C/EBP 环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）、骨膜蛋白、钙联蛋白、磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）一抗购自美国Abcam公司，游离脂肪酸（free fat acid, FFA）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）、腺苷酸（adenine nucleotides, AMP）、乳酸（lactic acid, LA）的ELISA试剂盒购自瑞士Roche公司，Ⅰ型胶原蛋白（collagen typeⅠ, Col Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（collagen typeⅢ , Col Ⅲ ）、NP-proBNP试剂盒购自深圳欣博盛公司。Vivid E9多普勒彩色超声（美国GE公司），JEM-2100型透射电镜（日本JEOL公司），CVB3病毒株（吉林大学动物医学院实验动物中心病毒室），病毒原液效价为1×10-3TCID50/L。

1.2 动物模型的复制及分组

50只雄性SPF级BALB/c新生小鼠由广西中医药大学基础医学院实验动物中心提供。随机分为对照组、模型组，以及低、中、高剂量组，每组10只。模型组与氧化苦参碱（低、中、高剂量）组均腹腔注射0.1 ml 1×10-9TCID50 CVB3病毒；低、中、高剂量组在模型组基础上皮下注射氧化苦参碱13、26和52 mg/kg[6]。从注射病毒起每日记录小鼠的日常及死亡情况。

1.3 心脏多普勒超声检查

给药14 d后，使用GE Vivid E9彩色超声显像仪，对每组小鼠行经胸心脏超声心动图检查。经胸壁高频超声ML6-15探头，频率13 MHz，图像深度3.5 cm。采用10%水合氯醛（0.2 g/kg）腹腔注射麻醉小鼠，在二维超声引导下，用M型超声测定左室收缩末期内径（left ventricular end-systolic dimension,LVESd）、左室舒张末期内径（left ventricular enddiastolic dimension, LVEDd）、左室短轴缩短率（fractional shortening, FS）及左室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF），测量4个连续完整心动周期，计算平均值[7]。实验于广西中医药大学基础医学部完成。

1.4 病理取材及切片

心脏超声心动图检查后，采用腹主动脉放血方式处死小鼠，并在无菌状态下用眼科剪进行病理取材。将心肌样本投入到4%多聚甲醛溶液中，经乙醇脱水、石蜡包埋后，置于切片机中连续切片。经脱蜡、二甲苯透明后进行HE染色，另取一部分心肌样本投入4%戊二醛溶液中，待浸透样本后行透射电镜检查。

1.5 TUNEL鉴定心肌细胞凋亡

将培养48 h的心肌组织经0.1% Trition X-100透化后，漂洗3次，再滴加3%双氧水H2O2200μl，漂洗后加入蛋白酶K工作液置于常温下20 min。漂洗后加入TUNEL反应液（TdT+荧光素标记的dUTP）37℃恒温箱中避光孵育60 min；清洗后加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，最后用防荧光淬灭封片剂封片。随机移动组织切片，选取细胞分布较均匀的高倍视野，计数＞1 000个。在相邻的10个视野下，红褐色细胞即阳性细胞。凋亡指数（AI）=各视野阳性细胞数/视野所有细胞总数×100%。

1.6 ELISA

采用ELISA法检测各组小鼠左室心肌组织FFA、ATP、AMP、LAC、Col Ⅰ、Col Ⅲ及 NT-proBNP 的表达。于腹主动脉抽取2 ml动脉血置于促凝管中，3 000 r/min低温离心10 min，取上清液进行NT-proBNP检测，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.7 Western blotting检测

采用Western blotting检测各组小鼠左心室心肌组织中GRP78、CHOP、骨膜蛋白、钙联蛋白的表达。提取心室肌组织蛋白并测定浓度，取样20μl以10%SDS-PAGE电泳，常规转膜后脱脂奶粉封闭，加一抗anti-GRP78（1 ∶ 1 000）、anti-CHOP（1 ∶ 1 000）、anti-骨膜蛋白（1∶500）、anti-钙联蛋白（1∶800） 4℃孵育过夜，TBST洗脱3次，5 min/次。采用辣根过氧化酶标记二抗室温孵育2 h，TBST洗脱3次，10 min/次，用ECL化学发光显像[8]。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的灰度值/内参GAPDH的灰度值。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠心脏超声检查结果

对照组、模型组及低、中、高剂量组小鼠心脏LVEDd、LVEF及FS比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，模型组 LVEDd较对照组扩大（P＜0.05），LVEF和FS减小（P＜0.05）；低、中、高剂量组小鼠LVEDd、LVEF及FS较模型组有所改善，且呈剂量依赖性（P＜0.05）。见表 1和图 1。

表1 各组小鼠高频心脏超声数值变化 （n =10，±s）

表1 各组小鼠高频心脏超声数值变化 （n =10，±s）

注：1）与中剂量组比较，P ＜0.05；2）与低剂量组比较，P ＜0.05；3）与模型组比较，P ＜0.05；4）与对照组比较，P ＜0.05

组别 LVEDd/mm LVEF/% FS/%高剂量组 3.79±0.381） 83.49±4.241） 49.91±4.281）中剂量组 4.38±0.432） 79.52±4.622） 46.07±4.152）低剂量组 4.89±0.183） 74.75±3.643） 43.93±3.313）模型组 5.27±0.534） 67.31±5.734） 38.5±2.134）对照组 3.48±0.26 85.52±2.22 49.96±3.5 F值 16.581 19.360 26.780 P值 0.000 0.000 0.000

图1 小鼠心脏超声检查结果

2.2 各组小鼠心肌组织HE染色结果

模型组心肌纤维间隔较对照组增宽，细胞核排列紊乱，可见大量淋巴细胞浸润。高、中、低剂量组小鼠心肌纤维间隔较模型组紧密，细胞核排列有改善趋势，且呈剂量依赖性。见图2。

2.3 各组小鼠心肌细胞透射电镜结果

对照组心肌细胞肌纤维整齐，Z带、M带明显，线粒体完整，且细胞内无病毒迹象。模型组与照组比较，心肌细胞出现肌纤维溶解、异常收缩带、线粒体空泡化等现象，并在细胞质中出现直径30～70μm二十面体病毒，符合CVB3病毒形态。低、中、高剂量组小鼠心肌细胞心肌纤维溶解现象较模型组减轻，线粒体趋于完整，病毒数量减少，且呈剂量依赖性。见图3。

2.4 各组小鼠心肌组织AI比较

对照组、模型组,以及低、中、高剂量组小鼠心肌组织 AI分别为（3.26±0.85）、（76.39±5.14）、（39.66±4.87）、（26.42±2.74）、（15.43±1.74）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=53.786，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，模型组心肌组织AI较对照组升高（P＜0.05）；低、中、高剂量组AI较模型组下降，且呈剂量依赖性（P＜0.05）。见图4。

图2 各组小鼠心肌组织 （HE×200）

图3 各组小鼠心肌细胞 （透射电镜×3 000）

图4 各组小鼠心肌组织 （TUNEL×200）

2.5 各组小鼠心肌组织中FFA、ATP/AMP、LAC、NT-proBNP、Col Ⅰ及Col Ⅲ的表达

对照组、模型组，以及低、中、高剂量组小鼠心肌组织中FFA、ATP/AMP、LAC、NT-proBNP、Col Ⅰ及Col Ⅲ的含量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，模型组小鼠心肌组织中FFA、LAC、NT-proBNP、Col Ⅰ及Col Ⅲ含量较对照组升高（P＜0.05），ATP/AMP比值降低（P＜0.05）；低、中、高剂量组心肌组织中FFA、LAC、NT-proBNP、Col Ⅰ及Col Ⅲ含量较模型组降低，ATP/AMP比值升高，且呈剂量依赖性（P＜0.05）。 见表2。

表2 各组小鼠心肌组织中FFA、ATP/AMP、LAC、NT-proBNP、Col Ⅰ及Col Ⅲ的表达比较 （n =10，±s）

表2 各组小鼠心肌组织中FFA、ATP/AMP、LAC、NT-proBNP、Col Ⅰ及Col Ⅲ的表达比较 （n =10，±s）

注：1）与中剂量组比较，P ＜0.05；2）与低剂量组比较，P ＜0.05；3）与模型组比较，P ＜0.05；4）与对照组比较，P ＜0.05

组别 FFA/（nmol/mg） ATP/AMP LAC/（nmol/mg） NT-proBNP/（ng/L） Col Ⅰ /（ng/mg） Col Ⅲ /（ng/mg）高剂量组 195.48±13.331） 8.57±0.691） 336.87±28.631） 449.78±42.351） 81.26±6.331） 55.11±3.311）中剂量组 227.28±11.152） 6.08±1.032） 376.39±21.392） 834.91±57.322） 90.46±6.282） 64.56±4.582）低剂量组 257.39±8.493） 4.63±0.363） 400.58±36.213） 1 168.36±85.223） 113.56±4.353） 73.64±4.363）模型组 277.63±15.274） 2.84±0.694） 468.94±29.884） 1 468.69±73.614） 124.63±9.684） 79.74±6.614）对照组 185.67±8.14 9.37±1.12 316.58±25.37 316.84±35.05 72.94±10.58 45.24±3.38 F值 53.786 12.674 32.482 73.496 22.64 26.763 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.004 0.006

2.6 各组小鼠心肌组织中GRP78、CHOP、骨膜蛋白及钙联蛋白的表达

对照组、模型组，以及低、中、高剂量组小鼠心肌组织中GRP78、CHOP、骨膜蛋白及钙联蛋白的表达比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，模型组小鼠心肌组织中GRP78、CHOP、骨膜蛋白表达较对照组升高（P＜0.05），钙联蛋白表达下降（P＜0.05）；低、中、高剂量组心肌组织中GRP78、CHOP、骨膜蛋白表达较模型组降低，钙联蛋白表达升高，且呈剂量依赖性（P＜0.05）。见表3和图5。

表3 各组小鼠心肌组织中GRP78、CHOP、骨膜蛋白及钙联蛋白的表达比较 （n =10，±s）

表3 各组小鼠心肌组织中GRP78、CHOP、骨膜蛋白及钙联蛋白的表达比较 （n =10，±s）

注：1）与中剂量组比较，P ＜0.05；2）与低剂量组比较，P ＜0.05；3）与模型组比较，P ＜0.05；4）与对照组比较，P ＜0.05

组别 GRP78 CHOP 骨膜蛋白 钙联蛋白高剂量组 0.24±0.011） 0.33±0.021） 0.21±0.001） 0.91±0.041）中剂量组 0.38±0.022） 0.39±0.052） 0.49±0.032） 0.58±0.042）低剂量组 0.64±0.053） 0.56±0.033） 0.71±0.053） 0.31±0.023）模型组 0.81±0.064） 0.84±0.054） 1.02±0.044） 0.22±0.034）对照组 0.07±0.01 0.36±0.02 0.26±0.02 1.23±0.07 F值 17.549 18.263 14.322 21.764 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

图5 各组小鼠心肌组织中GRP78、CHOP、骨膜蛋白及钙联蛋白的表达

3 讨论

氧化苦参碱又叫苦参素，是中药苦参中的有效成分之一，具有多重生物效应，如抗肿瘤、抗血管生成、保护血管内皮、调节免疫等[8-10]。大量研究证实，氧化苦参碱可通过抑制二甲基精氨酸、凋亡相关因子的表达，减少心肌细胞凋亡，从而改善心衰大鼠心功能，抑制心室重构[4-5]。但氧化苦参碱对病毒性心肌炎所致心衰的心肌能量代谢的影响未见报道。本研究对BALB/c小鼠腹腔无菌注射CVB3复制病毒性心肌炎所致心衰模型，并通过心脏多普勒彩色超声及透射电镜等途径，从宏观和微观角度证实病毒性心肌炎所致心衰模型成立。

本研究发现，小鼠注射CVB3病毒14 d后，心脏室壁变薄、LVEF下降、心腔扩大，符合心室重构改变。通过透射电镜观察发现，细胞内出现直径30～70 nm类似二十面体病毒，大量线粒体呈空泡化，说明病毒性心肌炎所致心衰小鼠模型成立，且CVB3病毒对线粒体完整性有一定影响。而应用氧化苦参碱后，心脏超声显示心室重构指标明显改善，病毒数量减少，心肌细胞超微观结构有所改变，说明氧化苦参碱可能具有一定的抗病毒作用，减少心肌线粒体的破坏，改善心肌细胞能量供给，从而起到逆转心室重构的作用。这与杨志伟等[11]的研究结果有一定相似之处。

本实验进一步观察氧化苦参碱对病毒性心肌炎所致心衰小鼠心肌能量代谢的影响，结果发现，模型组小鼠心肌组织中FFA、LAC表达升高，ATP/AMP比值下降，其中LAC是FFA与葡萄糖酵解产物，两者在心肌细胞内过度堆积，可导致心肌细胞酸中毒，引发能量代谢紊乱及细胞凋亡[12-13]。而氧化苦参碱可使FFA、LAC含量下降，ATP/AMP比值上升，说明氧化苦参碱可能通过抗病毒，改善心肌细胞酸中毒，改善心肌细胞能量代谢，这可能是氧化苦参碱改善心衰的重要因素之一。SHIMAZAKI等[14]研究证实，骨膜蛋白在心肌病理状态下，与胶原纤维的生成关系密切。而国内学者研究发现，骨膜蛋白可与Col Ⅰ直接交联，加速细胞外基质的整合与沉积，从而加速心肌纤维化程度[15]。钙联蛋白是Calnexin/Calreticulin循环的重要组成部分，具有多重生物学功能，其中调控蛋白折叠、装配及内质网Ca2+稳态是其主要功能[16]。钙联蛋白低表达可使内质网内未折叠与错误折叠积聚过多，激发内质网应激（ERS）凋亡通路。本研究发现，病毒性心肌炎心衰小鼠心室肌组织中GRP78、CHOP、骨膜蛋白表达升高，钙联蛋白表达下降，而氧化苦参碱可使GRP78、CHOP、骨膜蛋白表达下降，钙联蛋白表达上升。笔者认为，氧化苦参碱可能抑制心肌纤维化，增加心室肌顺应性，起到逆转心室重构、改善心衰的作用，这一点也通过心室肌Col Ⅰ、Col Ⅲ结果得到证实。已有研究发现，ERS所引发的心肌细胞凋亡存在于病毒性心肌炎小鼠心肌内[17]。结合本研究结果分析，氧化苦参碱抑制ERS细胞凋亡可能是通过增加钙联蛋白表达，延长钙联蛋白与未折叠蛋白、错误折叠蛋白接触时间，进而缓解ERS，挽救工作心肌细胞，达到改善心衰的目的。值得注意的是，CVB3病毒破坏心肌细胞线粒体，导致心肌细胞内供能不足，也可能导致心肌细胞内Ca2+紊乱及运转能力不足，激发ERS所致心肌细胞凋亡，引发心衰，这部分研究笔者将在后续进一步研究中加以论证。

综上所述，氧化苦参碱可能通过保护线粒体完整性、减轻心肌细胞ERS所致凋亡等机制，改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠心肌能量代谢，逆转心室重构，发挥抗心衰的作用。