骨桥蛋白对小鼠胆囊结石形成的作用及其机制探讨

郭满，张浩，李伟汉

（郑州大学附属南阳医院 乳腺甲状腺外科，河南 南阳 473009）

胆囊结石是常见的消化系统疾病，随着人们生活方式的改变，胆囊结石尤其胆固醇结石发病率呈不断升高趋势[1]。人体胆固醇代谢和转运失衡可导致胆囊胆固醇结石患病率升高[2]。既往研究发现，骨桥蛋白（Osteopontin, OPN）可以影响肝脏胆固醇的合成、转运及小肠胆固醇吸收，从而影响胆固醇结石的形成[3-4]。胆固醇结石形成是一个多步骤、多环节的代谢疾病，胆囊的病理生理状态对胆结石的形成亦有至关重要的影响。因此，本实验研究OPN敲除对胆囊胆固醇转运的影响，以期进一步理清OPN调节胆囊胆固醇结石形成的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及标本采集

7只C57BL/6J小鼠购于复旦大学作为对照组，7只相同背景OPN敲除小鼠购自美国杰克逊实验室作为敲除组。室温（22±2）˚C、湿度（60±10）%环境饲养。适应性饲养1周后开始实验。两组小鼠相同环境分笼饲养，敲除组小鼠喂养致石饲料（普通小鼠饲料添加15%脂肪，2%胆固醇，0.5%胆酸），投食3或4次/d，不限饮水，饲料由上海史莱克公司提供。喂养8周后，收集胆囊胆汁，肉眼及偏光显微镜（日本奥林巴斯公司）下观察胆汁成石及胆固醇结晶情况。剩余胆汁4℃、15 000 r/min离心15 min，加入胆汁保存液，置于-70℃冷冻保存备用。收集胆囊组织液氮速冻用于蛋白质和RNA提取。本实验经郑州大学附属南阳医院动物伦理委员会审核批准。

1.2 胆结石形成分析与胆汁生化检测

胆固醇结石定义为胆囊内肉眼可见。胆固醇晶体定义为偏光显微镜（日本奥林巴斯公司）可见。胆汁胆固醇、胆汁酸和三酰甘油含量测定按ELISA试剂盒说明书进行，胆固醇过饱和指数（cholesterol saturation index, CSI）按照Carey表格计算。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应

采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）测定ATP结合盒转运子G亚家族成员5/8（ATP binding cassette transporter sub-family G member 5/8, ABCG5/ABCG8）及肝脏X受体（liver X receptor, LXR）在胆囊组织中的表达。按Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）说明书提取组织标本的RNA。mRNA测定按qRT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）说明书进行，检测采用ABI 7900HT快速qRT-PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。反应条件：94℃预变性30 s，60℃变性 30 s，72℃退火 45 s，72℃延伸 10 min，共40个循环。阈值循环（Ct）为在该荧光通过的固定阈值的分数循环数，使用2-ΔΔCT法，以GAPDH为对照，计算相对表达量。PCR引物设计见表1。

表1 PCR引物序列

1.4 Western blotting检测

采用蛋白提取试剂盒提取胆囊组织总蛋白。使用BCA法测定蛋白浓度。参照试剂盒说明书进行Western blotting检测。抗体稀释度如下：抗ABCG5（1 ∶ 1 000），抗 ABCG8（1 ∶ 1 000），抗 LXR（1∶1 000），抗β-actin （1∶500）。Western blotting检测结果用化学发光法暴露于照相胶片。免疫反应带采用Image J软件参照β-actin进行量化。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用Fisher确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胆囊成石情况

致石饮食饲养8周后，对照组小鼠胆囊成石率为85.71%（6/7），敲除组为14.29%（1/7），经Fisher确切概率法，差异有统计学意义（P=0.029）。采用偏光显微镜观察敲除组小鼠胆汁清亮，而对照组小鼠胆汁浑浊且存在大量胆固醇结晶。见图1。

2.2 胆囊炎症情况

致石饮食饲养8周后，对照组小鼠胆囊黏膜增厚且局部有大量炎症细胞浸润，而敲除组小鼠黏膜未见上述表现。见图2。

图1 小鼠胆汁胆固醇结晶及胆固醇结石

图2 两组小鼠胆囊黏膜 （HE×100）

2.3 OPN敲除改变胆汁胆固醇含量和CSI指数

实验前两组小鼠胆囊体积、胆汁胆固醇、磷脂含量、胆汁酸含量及CSI比较，经t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。喂食致石饮食8周后，两组小鼠胆囊体积、胆汁磷脂含量和胆汁酸含量比较，经t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组小鼠胆汁胆固醇含量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），敲除组较对照组低。两组小鼠CSI比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），敲除组较对照组低。见表2。

表2 两组小鼠胆囊体积，胆汁胆固醇、磷脂、胆汁酸含量及CSI比较 （n =7，±s）

表2 两组小鼠胆囊体积，胆汁胆固醇、磷脂、胆汁酸含量及CSI比较 （n =7，±s）

注：t1、P1为两组实验前比较，t2、P2为两组实验后比较

组别胆囊体积/μl胆汁胆固醇含量/（mmol/L）磷脂含量/（mmol/L）胆汁酸含量/（mmol/L）CSI敲除组实验前 23.2±5.01 2.75±0.77 24.19±2.75 56.68±8.34 0.47±0.09实验后 26.9±7.62 5.35±1.08 26.31±2.21 84.07±5.97 0.55±0.07对照组实验前 24.6±7.45 2.31±0.46 23.76±2.21 61.37-7.63 0.45±0.10实验后 23.5-5.31 9.34+0.85 28.40±3.49 77.81±8.21 1.09±0.12 t1值 0.472 1.283 0.323 1.098 0.409 P1值 0.645 0.225 0.752 0.294 0.691 t2值 0.964 7.134 1.563 1.695 8.621 P2值 0.354 0.001 0.144 0.113 0.002

2.4 OPN敲除对胆囊ABCG5、ABCG8及LXR表达的影响

2.4.1 mRNA 实验前两组小鼠ABCG5、ABCG8及LXR mRNA表达水平比较，经t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。致石饮食饲养后敲除组和对照组小鼠胆囊ABCG5 mRNA相对表达量分别为（0.47±0.08）和（1.01±0.07），经t检验，差异有统计学意义（t=13.172，P=0.001）。敲除组和对照组小鼠胆囊ABCG8 mRNA相对表达量分别为（0.53±0.07）和（1.04±0.11），经t检验，差异有统计学意义（t=13.714，P=0.001）。敲除组和对照组小鼠胆囊LXR mRNA相对表达量分别为（0.49±0.08）和（1.01±0.06），经t检验，差异有统计学意义（t=10.473，P=0.002）。见图3。

2.4.2 蛋白 致石饮食饲养后敲除组和对照组小鼠胆囊ABCG5蛋白相对表达量分别为（0.51±0.06）和（1.03±0.08），经t检验，差异有统计学意义（t=11.838，P=0.002）。敲除组和对照组小鼠胆囊ABCG8蛋白相对表达量分别为（0.48±0.07）和（1.01±0.10），经t检验，差异有统计学意义（t=12.913，P=0.001）。敲除组和对照组小鼠胆囊LXR蛋白相对表达量分别为（0.58±0.09）和（0.99±0.07），经t检验，差异有统计学意义（t=8.127，P=0.003）。见图4。

图3 实验前后两组小鼠ABCG5、ABCG8和LXR mRNA表达水平比较 （n =7，±s）

图4 两组小鼠实验前后ABCG5、ABCG8和LXR蛋白的表达

3 讨论

本研究发现，OPN敲除小鼠具有更低的胆汁胆固醇含量，更低的饮食诱发胆结石形成率。本研究还发现，致石饮食喂养8周后两组小鼠胆囊容积无差异，表明OPN敲除并未对小鼠胆囊运动、排空功能产生影响。生化分析显示，OPN敲除小鼠胆汁中胆固醇含量较C57BL/6J小鼠降低，而胆汁酸和磷脂含量无明显变化，使敲除组小鼠胆囊胆汁具有更低的CSI，表明OPN敲除对小鼠胆囊结石形成的保护作用来自于降低了胆汁中胆固醇的含量。

胆固醇在机体内的代谢是一个多器官、多步骤的过程。ABCG5和ABCG8是三磷酸腺苷结合盒（ABC）G亚家族中超家族成员，两者在细胞内以异二聚体方式结合，组成跨膜转运蛋白，参与胆固醇代谢，调节胆囊胆固醇结石形成[5]。肝脏组织过表达ABCG5和ABCG8可导致肝脏胆汁中胆固醇过饱和[5]。胆囊胆固醇结石患者胆囊组织中也存在ABCG5和ABCG8过表达的现象[6]。研究发现，胆囊组织表达ABCG5和ABCG8的功能是将胆固醇从胆囊上皮细胞排泄至胆囊腔内，起到提高和维持胆汁胆固醇浓度的作用[7-8]。因此，肝脏胆固醇代谢失衡是导致胆汁胆固醇过饱和的起始条件，而胆囊组织胆固醇代谢失衡，则使胆囊胆汁中过饱和的胆固醇得以维持和继续，并最终促使胆囊中胆固醇的析出、结晶，以至最终胆囊胆固醇结石的形成。OPN参与胆固醇结石形成的调节，然而确切机制仍不明确。NUNEZ-GARCIA等[9]研究发现，OPN敲除小鼠体内的胆固醇代谢酶CYP7A1表达升高，而且体外细胞学实验发现OPN对肝细胞内CYP7A1的抑制作用是通过FAK-Akt信号通路实现的。本研究发现，OPN敲除小鼠较对照组具有更低的胆囊ABCG5/ABCG8蛋白和mRNA表达水平，而胆囊组织中ABCG5/ABCG8的表达减少导致胆囊细胞向胆汁中排泄胆固醇减少。LXR是核受体家族的成员，对机体胆固醇代谢有重要调节作用[10]。在饮食诱导胆固醇结石的研究中发现，LXR对ABCG5、ABCG8和CYP7A1等胆固醇代谢关键因子发挥调节作用[11-12]。本研究发现，OPN敲除小鼠胆囊组织LXR表达水平较对照组降低，表明OPN可能通过作用于LXR从而调节ABCG5/ABCG8的表达。LIMA-CABELLO等[13]研究发现，非酒精性脂肪肝组织中存在LXR、OPN及炎症调节因子TNF-α和IL-6等过度表达。仝莎等[14]研究发现，TNF-α可通过调节LXR启动子活性，从而抑制HepG2细胞内胆固醇外流，导致肝细胞内脂质异常积聚。本研究对小鼠胆囊进行组织学检查，结果发现OPN敲除小鼠较对照组胆囊黏膜炎症较轻，炎细胞浸润较少，这提示OPN下调可以减轻胆囊局部炎症。

本研究对OPN调节胆固醇代谢，影响胆固醇结石形成的机制进行进一步的探讨，发现OPN通过减轻胆囊组织炎症反应，减少LXR表达，减少胆囊ABCG5、ABCG8的表达，降低胆囊胆汁中胆固醇浓度，最终降低胆结石形成率。