GDNF对MPTP诱导帕金森病小鼠黑质TH mRNA、Ephrin B2、p-c-Jun的影响*

吴少璞，祁亚伟，李学，杨红旗，马建军

（河南省人民医院 神经内科，河南 郑州 450002）

帕金森病以多巴胺能神经元减少为主要病理改变[1]。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line de-rived neurotrophic factor, GDNF）对退化的多巴胺能神经元产生保护作用[2]。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine, MPTP）具有明显的神经毒性，目前广泛用于复制帕金森病动物模型[3]。本文以MPTP诱导帕金森病模型小鼠作为研究对象，旨在探讨GNDF对帕金森病形成相关因子酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）、Ephrin B2、磷酸化c-Jun（phos-phorylated c-Jun, p-c-Jun）的影响，为帕金森病的病理研究和临床治疗提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

120只健康雄性SPF级小鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2006-0009]，饲养条件：温度（24±2）℃，相对湿度（55±5）%，12 h昼夜循环适应性喂养7 d，小鼠体重（20±2）g。

1.2 实验试剂

MPTP（美国ApexBio公司），GDNF（美国Thermo公司），水合氯醛溶液（北京雷根生物技术有限公司），GDNF（美国ProSpec公司），逆转录试剂盒（上海Biomiga公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）试剂盒（美国GeneCopoeia公司），免疫组织化学Ephrin B2和p-c-Jun一抗购自上海艾博抗贸易有限公司，抗兔IgG（二抗）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 单侧侧脑室埋管术 所有实验小鼠适应性喂养后行右侧侧脑室埋管术。术前小鼠禁食12 h，采用水合氯醛400 mg/kg腹膜腔注射麻醉，待小鼠角膜反射消失提示麻醉完成。麻醉后切开小鼠头部皮肤，暴露颅骨，采用三菱针穿刺颅骨表面右侧侧脑室代表区（具体位置为矢状缝右侧1.0 mm与前囟后0.3 mm交点），穿刺深度约为2.2 mm。穿刺后将不锈钢外置管（长7.0 mm，外径0.7 mm，内径0.5 mm）沿穿刺孔置入右侧侧脑室，采用101胶和牙托粉将外套管固定，外置管内放置针芯避免外置管堵塞。术后3 d为恢复期，恢复期内小鼠腹膜腔内注射青霉素预防术后感染，注射量为2万u/d。

1.3.2 帕金森病模型的复制 术后4 d随机挑取84只小鼠复制帕金森病模型。小鼠腹膜腔注射MPTP 0.15 mg/10 g 10 d复制帕金森病模型[4]。剩余36只小鼠注射等量生理盐水作为对照组。模型复制成功后观察小鼠一般情况，观察其有无动作迟缓、活动减少、尾部僵直等。最后77只小鼠模型复制成功，随机选取72只并按随机对照原则将其分为模型组和实验组，每组36只。

1.3.3 侧脑室注射 采用微量注射器通过外置管向小鼠右侧侧脑室内注入药物，其中对照组和模型组注射生理盐水1μl，实验组小鼠注射GDNF生理盐水1μl（GDNF溶解于生理盐水中，浓度为1.0μg/μl），3次/d，连续注射10 d。

1.3.4 模型复制成功标准 每日观察3组小鼠侧脑室注射后的行为活动，并于侧脑室注射第10天对3组小鼠进行不对称旋转行为检测。具体方法：向模型动物颈部皮下注射0.05 mg/kg去水吗啡（APO），诱导小鼠向健侧旋转，小鼠出现转圈行为后开始记录小鼠30 min内转圈数，并算出平均值，平均转圈数＞7次/min则视为帕金森病小鼠模型复制成功。

1.4 观察指标

1.4.1 多巴胺能神经元数和Ephrin B2、p-c-Jun蛋白 每组随机选取24只小鼠，麻醉后采用40 g/L多聚甲醛对小鼠脑组织进行灌注固定，取出小鼠脑组织后放入40 g/L多聚甲醛，在4℃环境下固定过夜。将脑组织置于20%蔗糖溶液中沉底，转入30%蔗糖溶液中沉底，将含有黑质的脑组织进行冠状面冷冻切片，切片厚度1 mm，样品在-80℃冰箱内保存。将其中12只小鼠中含有黑质、纹状体部位的脑片进行TH染色，采用光学分流阀计算TH阳性神经元数。将另外12只小鼠脑片中包含黑质的脑片进行SP免疫组织化学染色，检测3组小鼠黑质中Ephrin B2和p-c-Jun蛋白表达水平，按照试剂盒说明书进行操作，其中阴性对照一抗用磷酸盐缓冲液代替，其余方法相同。用显微镜进行观察，阳性细胞呈棕黄色。每个脑片中随机选取5个视野计算阳性细胞数。

1.4.2 脑黑质TH mRNA 每组随机选取12只小鼠，快速断头后于冰上将小鼠黑质部位分离出，置入液氮中进行保存，供qRT-PCR使用。提取小鼠黑质总RNA，采用Trnizol试剂，按照试剂盒说明书进行逆转录。采用qRT-PCR仪（美国Bio-Rad公司）对逆转录产物进行检测。GAPDH正向引物：5'-GCCAAGGTCATCCATGACAAC-3’，反向引物：5’-AGTGTAGCCCAAGATGCCCTT-3’，产物长度为351 bp；TH正向引物：5’-GGTATACGAC ACGCTGAAGG-3’，反向引物：5’-TAGCCACAGTA CCGTTCCAGA-3’，产物长度为90 bp。PCR反应条件：95℃预变性2 min；94℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；熔解曲线：95℃1 min，55℃1 min，55～98℃（10 s/循环，0.5℃/循环）86个循环。计算各样品ΔCt值，以对照组为校正样品，计算目的基因相对表达量。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，qRT-PCR重复3次。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析，或重复测量设计的方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GDNF对小鼠行为学的影响

所有小鼠侧脑室埋管成功，全部存活。3组小鼠模型复制后、注射后5和10 d的转圈数比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点小鼠转圈数有差异（F=273.454，P=0.000）；②3组小鼠转圈数有差异（F=484.573，P=0.000）。③3组小鼠转圈数变化趋势有差异（F=321.234，P=0.000）。见表1。

表1 3组小鼠不同时间点的转圈数比较（n =36，r/30 min，±s）

表1 3组小鼠不同时间点的转圈数比较（n =36，r/30 min，±s）

组别 模型复制后 注射后5 d 注射后10 d对照组 2.7±1.4 2.5±1.7 2.5±1.5模型组 211.7±21.4 218.5±22.3 210.7±24.4实验组 227.5±27.4 163.4±18.4 142.6±19.5

2.2 GDNF对小鼠多巴胺能神经元数的影响

对照组小鼠健侧与毁损侧多巴胺能神经元数（TH阳性）比较，经t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组、实验组健侧与毁损侧多巴胺能神经元数比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），损毁侧少于健侧。3组健侧多巴胺能神经元数比较，经方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）；3组损毁侧多巴胺能神经元数比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组＜实验组＜对照组。见表2。

表2 3组小鼠多巴胺能神经元数比较（n =12，个，±s）

表2 3组小鼠多巴胺能神经元数比较（n =12，个，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05

组别 健侧 毁损侧 t值 P值对照组 219.1±18.9 228.5±15.3 1.328 0.198模型组 211.4±19.5 86.5±17.31） 16.600 0.000实验组 220.4±21.9 157.5±22.91）2） 7.965 0.000 F值 1.404 85.862 P值 0.252 0.000

多巴胺能神经元经DBA显色后呈现棕褐色。对照组损毁侧神经元与健侧比较，无明显差异；模型组和实验组损毁侧神经元数较健侧明显减少。见图1。

2.3 GDNF对小鼠黑质TH mRNA表达的影响

qRT-PCR产物凝胶电泳结果见图2。以对照组（1.00±0.00）作为矫正，模型组和实验组TH mRNA相对表达量分别为（0.82±0.07）和（0.97±0.06），经方差分析，差异有统计学意义（F=3899，P=0.000），对照组＞实验组＞模型组（见图3）。

2.4 GDNF对小鼠黑质Ephrin B2、p-c-Jun蛋白表达的影响

3组小鼠黑质Ephrin B2阳性神经元数比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组高于对照组和实验组。3组小鼠黑质p-c-Jun阳性神经元数比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组高于对照组和实验组。见表3。

图1 GDNF对MPTP诱导帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元数的影响 （SP×20）

图2 小鼠脑黒质中TH mRNA的表达

图3 各组小鼠黑质TH mRNA表达水平比较（n =12，±s）

表3 3组小鼠黑质Ephrin B2、p-c-Jun阳性神经元数比较 （n =12，个，±s）

表3 3组小鼠黑质Ephrin B2、p-c-Jun阳性神经元数比较 （n =12，个，±s）

注：†与对照组比较，P ＜0.05

组别 Ephrin B2阳性 p-c-Jun阳性对照组 10.2±2.4 9.8±1.8模型组 13.8±2.4† 32.3±6.5†实验组 10.9±2.7 15.6±2.1 F值 7.160 99.128 P值 0.003 0.000

3 讨论

帕金森病是老年人常见疾病，帕金森病主要的病理改变为中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，纹状体DA含量下降。帕金森病的治疗目前主要以口服多巴胺制剂为主，虽然具有一定临床效果，但是不能从根本上解决多巴胺能神经元的丧失[5]。GDNF具有促进神经细胞生长、分化、再生及修复的作用，补充GDNF是目前治疗帕金森病的辅助手段之一，能够延缓疾病的进展，减少神经细胞退变[6]。动物实验证实，GDNF能够促进多巴胺能神经元分化，提高多巴胺能神经元存活，对神经具有保护和修复作用[7]。MPTP具有高亲脂性，能够透过血脑屏障进入脑内，经过代谢后会产生1-甲基-4-本基吡啶离子（MPP+），MPP+能够损毁黑质内多巴胺能神经元，造成多巴胺含量降低。此外，MPTP代谢产物能够对多巴胺合成的限速酶TH产生抑制作用，从而降低多巴胺的合成[8]。目前复制动物模型的常用方法包括神经毒素诱导、转基因、基因敲除等，其中采用MPTP诱导的帕金森病动物模型具有与人帕金森病类似的症状、病理改变，且症状相对稳定、成本较低[9]。小鼠对MPTP较为敏感，因此本研究采用脑内注射MPTP复制帕金森病小鼠模型。

本研究中模型组黑质TH阳性神经元数与对照组相比明显降低，实验组注射GDNF后黑质TH阳性神经元数高于模型组。结果说明实验组动物神经损伤程度高于对照组，低于模型组，GNDF对帕金森病小鼠的神经损伤有改善，能增加TH阳性神经元数，提高神经纤维密度。有研究认为，GDNF具有神经元保护作用主要与GDNF受体家族α1（GFR-α-1）和Ret受体有关，其中GFR-α-1是一个配体、受体复合体，是磷脂酰肌醇锚定到细胞表面上的蛋白质分子[10]；Ret是一个受体酪氨酸激酶，参与细胞内的信号转导，GDNF能够与GFR-α-1特异性结合，同时Ret被磷酸化，并将信号转入细胞内，激活丝裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶C等，从而激活细胞内一系列信号转导通路，发挥保护神经元的作用[11]。

TH是多巴胺合成第一步的限速酶，根据相关研究，帕金森病患者TH含量明显降低[12]。研究显示，帕金森病动物模型脑组织中TH mRNA表达量较正常组低，说明帕金森病的发生与TH的失活密切相关[13]。TH可以间接反映多巴胺能神经元的存活状态，因此可以将TH作为反映多巴胺能神经元存活的蛋白标志物[14]。本研究通过检测TH mRNA表达量反映TH表达的稳定性。本研究中，模型组小鼠TH mRNA表达量较对照组和实验组低，而实验组TH mRNA表达量相比对照组无明显差异。研究结果表明，GDNF能够提高帕金森病模型小鼠TH的表达水平。陈立等[15]的研究表明，GDNF能够提高体外培养的神经干细胞TH表达量，与本研究结果相符。说明GDNF能够对受损多巴胺能神经元进行修复，提高TH mRNA的表达。

Ephrin B2是受体酪氨酸激酶亚家族Eph的配体，参与神经系统的生长、发育，与细胞迁移、轴突导向、神经环路合集、突出信息等关系密切[16-17]。Ephrin B2参与神经性疼痛及炎症性调控。相关研究显示，在神经元受损时，Ephrin B2表达水平升高[18]。本研究中，模型组小鼠Ephrin B2水平明显高于对照组，可能与MPTP引起多巴胺能神经元损伤有关。多巴胺能神经元坏死后引起局部炎症反应，导致局部Ephrin B2表达升高。本研究中，实验组小鼠Ephrin B2表达低于模型组，分析其原因可能为GDNF通过下调Ephrin B2的表达，降低因MPP+对神经元产生的损伤及诱导的炎症反应，改善神经受损，有利于多巴胺能神经元的修复。

c-Jun是一种转录调节因子，属于亮氨酸拉链家族成员，其磷酸化后会引起神经兴奋性中毒或神经元的死亡。c-Jun氨基末端激酶（JNK）属于促分裂原活化蛋白激酶家族（MAPK），其活化后能引起c-Jun磷酸化。相关研究显示，MPTP引起的神经元死亡主要是通过JNK信号通路实现的，MPP+能够引起c-Jun磷酸化形成p-c-Jun，并且使其表达量升高，从而激活JNK传导通路，引起神经元损伤[19]。研究显示，MPTP能够使小鼠脑组织中c-Jun蛋白磷酸化，磷酸化部位以黑质多巴胺能神经元为主[20]。本研究中，模型组小鼠纹状体中p-c-Jun高于对照组。实验组小鼠p-c-Jun低于模型组，说明GDNF能够减小MPTP对c-Jun产生的磷酸化作用，从而降低p-c-Jun水平，避免引起JNK信号通路紊乱，发挥保护多巴胺能神经元的作用。

综上所述，GDNF能够提高MPTP诱导帕金森病模型小鼠黑质TH的表达，降低Ephrin B2和p-c-Jun蛋白的表达，进而对小鼠多巴胺能神经元产生保护作用，提示GNDF可能在治疗人帕金森病上具有一定价值。