翘嘴鲌生长激素基因侧翼2个微卫星位点与生长性状的关联分析

刘士力，蒋文枰，程 顺，迟美丽，郑建波，贾永义，*，赵金良，顾志敏

(1.浙江省淡水水产研究所 农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室/浙江省淡水水产遗传育种重点实验室，浙江 湖州 313001； 2.上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306； 3.上海海洋大学 上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306； 4.上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306)

生长激素基因(growth hormone，GH)是影响动物生长性状的主效基因[1]，具有提高饲料转化率[2]、促进肌肉中的蛋白质合成[3]、加速鱼类骨骼纵向生长[4]等重要作用。作为生产性能的候选基因，已经有不少学者在黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[5]、猪(Susscrofa)[6]、牛(Bostaurus)[7]、鸡(Gallusgallus)[8]等物种上做过研究，并发现了一些与重要经济性状相关的多态位点。微卫星和小卫星存在于数种鱼GH基因的启动子或内含子中，包括尖吻鲈(Latescalcarifer)[9]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[10]和金头鲷(Sparusaurata)[11]等。当串联重复序列位于基因的调控区域时，它们可以直接影响其表达，从而引起这些基因数量性状的变化[12]。正是这些序列重复数目和长度的不同导致了GH基因的多态性。

翘嘴鲌(CulteralburnusBasilewsky)是鲌亚科中体型最大的一种鱼类，其肉白而细嫩，味美而不腥，具有重要的经济价值。翘嘴鲌又称翘嘴红鲌、白条鱼、大白鱼等，广泛分布于中国各大水系[13]。此外，翘嘴鲌是以活鱼为主食的凶猛肉食性鱼类，对维持淡水水域生态系统的稳定具有重要作用。采用分子标记技术为辅助手段可以提供育种效率，已开发了一些翘嘴鲌微卫星引物[14-15]，但对于明确的重要功能基因的遗传标记研究较少，暂未发现与生长性状显著相关的标记[16]。关于翘嘴鲌GH基因与侧翼区的序列已被报道[17]，翘嘴鲌GH基因内含子中不包含微卫星序列，但在其侧翼两端各包含1个微卫星序列。本实验通过引物设计、PCR扩增、片段分型和数据分析，研究这2个微卫星位点的遗传多样性，并将微卫星基因型和翘嘴鲌的体长、体质量进行相关性分析，以期为翘嘴鲌的微卫星特征研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用翘嘴鲌采自浙江省淡水水产研究所综合实验基地，为同塘养殖的翘嘴鲌个体，且苗种来源于同一批次繁殖的后代。剪取少量尾鳍，用无水乙醇消毒后于-20 ℃保存备用。

主要试剂：PCR反应试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司；用于DNA提取的试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用苯酚-氯仿法提取样本DNA。用1%琼脂糖凝胶检测提取DNA完整性，DNA原液于-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计

根据GenBank公布的翘嘴鲌GH基因及其侧翼DNA序列(登录号：KX925976.1)，利用Primer 6.0软件设计2对特异性引物用于2个微卫星位点的扩增，上游引物的5端加上Tail A碱基序列[18]，通用引物Tail A 5端用FAM进行修饰。具体引物序列见表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR反应体系

PCR反应体系20 μL: PCR Mix 10 μL，模板DNA (10 ng·μL-1) 1 μL，通用引物Tail A、上游和下游引物(10 μmol·L-1)分别为0.2 μL、0.2 μL和0.4 μL，灭菌超纯水补足体系。

PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；60 ℃30 min；4 ℃保存。

1.2.4 微卫星分型

PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行微卫星分型。

1.2.5 数据分析

采用POPGENE 1.3.1计算2个微卫星座位在该群体内的观测等位基因数(observed number of alleles，Na)、有效等位基因数(effective number of alleles，Ne)、观察杂合度(observed heterozygosity，Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity，He)和多态信息含量(polymorphism information content，PIC)。运用SPSS 13.0的一般线性模型(general linear model，GLM)程序分析2个微卫星位点与翘嘴鲌体质量、体长的关系。显著性分析用单因素方差分析(ANOVA)的Duncan氏法进行多重比较，P<0.05为差异显著。结果以平均值±标准误表示。统计模型如下：

Yij=μ+Gi+eij

其中：Yij为生长性状第i个基因型第j尾个体的观测值，μ为实验观测所有个体的平均值，Gi为微卫星标记第i种基因型的固定效应，eij为对应于观测值的随机误差。

2 结果与分析

2.1 翘嘴鲌GH基因侧翼微卫星位点

PCR扩增产物的电泳条带清晰、无杂带，片段长度为300～500 bp，其大小与预期结果一致。根据原始序列(GeneBank登录号：KX925976.1)设计的原始引物扩增PCR产物大小分别为392、366 bp，加上使用的接头Tail A为15 bp，预计扩增的产物大小为407、381 bp。2个微卫星位点在24个样本中的微卫星分型结果表明，位点Cal-GH01检测到404、407和410共3种等位基因，位点Cal-GH02检测到366、375、378、381、384和387共6种等位基因(图1)。这2个微卫星位点均为3碱基重复，同一位点的不同等位基因之间的长度差异为3个碱基或其整数倍。因此，判断PCR结果准确，据此可初步确定获得正确的目的片段，可用于后续分析。

表1翘嘴鲌GH基因侧翼微卫星引物序列

Table1Primer sequences used for microsatellite amplification in the flanking regions ofCulteralburnusGHgene

引物名称Primers names序列(5'-3')Sequence (5'-3')产物长度Length/bp重复核心Repeat motifTail AFAM-GCCTCCCTCGCGCCACal-GH01-FGCCTCCCTCGCGCCACGGTAGACAGTCATCAGAAT407(AAT)8Cal-GH01-RCCACAACCATCCAATCAATTCal-GH02-FGCCTCCCTCGCGCCAACATCCTTCCAGAATCCTTC381(CTT)5 (TAA) 7Cal-GH02-RCAACCTACGCTACCATCTAA

正向引物中加下划线的序列为Tail A序列。

Underlined sequence in the forward primer signified the Tail A.

A-1和A-2为Cal-GH01；B-1和B-2为Cal-GH02。A-1 and A-2， Cal-GH01; B-1 and B-2， Cal-GH02.图1 翘嘴鲌GH基因侧翼2个微卫星位点Cal-GH01和Cal-GH02的分型图Fig.1 Genotyping map of microsatellite loci Cal-GH01 and Cal-GH02 in flanking regions of Culter alburnus GH gene

2.2 等位基因频率和基因型频率

120尾翘嘴鲌GH基因侧翼2个微卫星位点上共检测到9个等位基因(表2)。微卫星座位Cal-GH01检测到3个等位基因，分别为404、407和410 bp，对应的微卫星核心重复次数分别是7、8和9次。其中，等位基因407 bp的频率最高，达到了70.8%，等位基因404、410 bp的频率分别为16.2%和5.4%。微卫星座位Cal-GH02共检测到6个等位基因，分别为366、375、378、381、384和387 bp，对应的微卫星核心重复次数分别是7、10、11、12、13和14次。其中，等位基因381 bp的频率最高，达到了70.4%，其次为等位基因384和387 bp，其频率分别为12.5%和10.0%，

这3个等位基因为优势等位基因，共占92.9%；频率最小的为375 bp等位基因，仅为0.4%。

微卫星座位Cal-GH01中共发现6种基因型(表3)，其中407/407基因型的频率最高，达到了61.7%，其次为404/407和404/404基因型，其值分别为13.3%和9.2%。404/410基因型的频率最低，仅观察到1次。

微卫星座位Cal-GH02中共发现11种基因型(表3)，其中381/381基因型的频率最高，达到了50.0%，其次为381/384和381/387基因型，其值分别为19.2%和14.2%。除了表格中列举的基因型外，366/387和384/384基因型仅观察到2次，366/378、375/381和387/387基因型仅观察到1次。

2.3 遗传多态性参数

遗传特性分析结果表明：翘嘴鲌GH基因Cal-GH01位点的期望杂合度(He)为0.381 0，观测杂合度(Ho)为0.207 2，其有效等位基因数(Ne)为1.611 1，多态信息含量(PIC)为0.420 (0.250

2.4 二个微卫星位点与翘嘴鲌体长和体质量的关联分析

除去基因型数目小于3的数据后进行单因素方差分析。微卫星位点Cal-GH01与体长的分析结果表明：404/407型个体占样本数的13.3%，其体长最长；410/410型个体占样本数的2.5%，其体长最短。微卫星位点Cal-GH01与体质量的分析结果表明，407/410型个体占样本数的微卫星位点Cal-GH02中，366/381型个体占样本数的3.3%，其体长和体质量均表现最大，其体质量显著(P<0.05)大于其他基因型个体。384/387型个体占样本数的2.5%，其体长和体质量均表现最小，其体长小于其他基因型个体(表3)。

表2翘嘴鲌GH基因侧翼2个微卫星位点的等位基因频率

Table2Allele frequency of two microsatellite loci in flank regions ofCulteralburnusGHgene

Cal-GH01Cal-GH02等位基因Allele/bp重复次数Number of repeat频率Frequency/%等位基因Allele/bp重复次数Number of repeat频率Frequency/%404716.236672.9407870.8375100.441095.4378112.13811270.43841312.53871410.0

5.0%，其体质量最大，410/410型个体同时也是体质量较轻的基因型。Cal-GH01不同基因型个体体长和体质量均有差异，但差异均不显著(P>0.05)(表3)。

表3翘嘴鲌微卫星位点Cal-GH01和Cal-GH02不同基因型与生长性状的关联分析

Table3Association analysis between growth traits and different genotypes of Cal-GH01 and Cal-GH02 locus inCulteralburnus

位点Locus基因型Genotype频率Frequency/%体长Body length/cm体质量Body weight/gCal-GH01407/40761.717.34±0.34 a63.16±3.91 a404/40713.318.00±0.63 a67.93±6.46 a404/4049.215.63±0.62 a43.52±4.87 a407/4105.015.85±3.13 a73.85±19.71 a410/4102.515.07±0.36 a40.00±3.11 aCal-GH02381/38150.017.36±0.35 ab62.48±3.91 b381/38419.217.17±0.65 ab62.291±7.01 b381/38714.216.96±0.69 ab58.31±6.85 b366/3813.320.15±1.92 a99.93±23.96 a378/3813.315.72±4.98 ab87.43±28.77 b384/3872.515.12±0.83 b43.10±8.13 b

同一位点的同列数据后无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Data marked without the same lowercase letter in the same column of the same locus indicated significant differences atP<0.05.

3 讨论

虽然高通量测序技术发展迅速，但对于少量特定微卫星位点的检测，仍然需要进行PCR判别条带大小。现在较为流行的方法是基于激光检测系统的荧光标记，但需要用荧光染料标记特异的微卫星引物。采用荧光标记进行自动分型虽然方便快捷，但需对每对微卫星引物的1条引物进行荧光标记。如果实验需要采用较多引物的话，实验成本较高。很多实验室先用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染技术在8～12个个体中筛选多态性微卫星引物，再将扩增良好的多态性引物用荧光修饰。这样可以节省成本，但8～12个个体的样本量较小，有可能漏掉一些多态性较低的微卫星引物，使得对微卫星特性的研究存在偏差。而且PAGE费时费力，操作不规范也可能对实验人员健康造成影响。Steffens等[19]最早提出采用荧光标记的M13通用引物检测DNA基因型的方法。随后，Schuelke[20]通过实验将这种方法的原理及具体操作流程更细致化，并将这种方法称之为巢式PCR(nested PCR)。本研究将其应用于翘嘴鲌GH基因侧翼微卫星的检测，取得了良好的效果，表明采用该方法可以较精确地进行微卫星分型，值得在水产动物中推广。

生长激素基因是物种进化中相对保守的基因，近缘物种GH基因的多态性主要集中在内含子中。Almuly等[11，21]发现金头鲷GH基因非编码区内存在小卫星和微卫星的重复序列，其对于内含子1中小卫星saGHFIM的研究表明，具有长内含子的片段会抑制GH基因表达的活性。虽然在翘嘴鲌内含子中未发现微卫星和小卫星，但在侧翼发现了(AAT)8、(CTT)5和(TAA)7微卫星序列。本研究发现的2个微卫星位点有其自身的特点：Cal-GH01位点的404、407和410对应的重复次数分别为7、8和9次，重复次数均为连续的，而且重复次数为8次的占70.8%，推测重复次数为8的是其原始类型，由于Taq酶的滑动，增加或减少了1个重复而变得具有多态性。在同属鲤科的团头鲂(Megalobramaamblycephala)中也发现了(AAT)11微卫星序列，鲁双庆等[22]在鳜属(Siniperca)3种鱼GH第二内含子的相同位置均发现了“AG”微卫星序列。因此，在相近物种中，微卫星较为保守，可以对该位点在鲌亚科物种分化过程中的变化进行研究。Cal-GH02位点的366、375、378、381、384和387对应的重复次数分别为7、10、11、12、13和14次。除了重复次数为7的基因型，其余5种基因型均是连续的，而且重复次数为12次的占70.4%，重复13和14次占的比例分别为12.5%和10.0%。推测重复次数为12的是其原始类型，复制过程中倾向于重复次数的增加。

黄颡鱼的GH基因内含子中存在4个微卫星位点，且都具有较高的遗传多样性；其中，3个位点GA、TCTT和AC都与生长性状有显著或极显著的关联性，对于分子育种实践具有十分重要的意义[5]，本研究没有得到如此显著的结果。鱼类的生长是受多个基因调控的结果，个体之间GH基因的差别也不只存在于微卫星。采用分子标记辅助育种也不会局限于某几个位点，而是需要科学的数学模型进行综合评价。本实验中同塘养殖的120尾翘嘴鲌生长激素基因侧翼区微卫星位点Cal-GH01中，不同基因型个体体长和体质量均有差异，但差异均不显著(P>0.05)；Cal-GH02中，366/381型个体占样本数的3.3%，其体长和体质量均表现最大，其体质量显著大于其他基因型个体(P<0.05)，384/387型个体占样本数的2.5%，其体长和体质量均最小，其体长小于其他基因型个体。这2个微卫星位点中优势等位基因所占的比例较高，可在翘嘴鲌不同地理种群或者近缘物种中做进一步研究。