贲门胃底癌中CIP2A mRNA 表达与HER-2 基因的扩增及其意义

张洪兰 陈昊 张春芳 张昶 齐冬雪 李伟 刘新丽 刘华

连云港市第一人民医院1病理科，2中心实验室（江苏连云港222002）

贲门胃底癌阳性体征出现较晚，不易完整手术切除，多年来预后一直不见明显改善［1］，该类胃癌发生率近年呈现不断增高的趋势。错过最佳手术期，只能化疗，而普通化疗疗效不明显且副作用大，靶向化疗是目前效果最明显的治疗方法。因此，进一步阐明贲门胃底癌的发生、发展和转移的分子机制，寻找有效的靶标及相关的调节因子，对于提高该类胃癌的疗效具有重要的临床意义。

蛋白磷酸酶2A（PP2A）的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase2A，CIP2A）是一种近年来被发现的癌基因，可在后转录水平上调c-Myc 蛋白表达；癌基因HER-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）作为表皮生长因子受体家族成员之一，其介导的信号通路PI3K∕Akt∕mTOR 可增强c-Myc 的蛋白翻译［2］；而原癌基因c-Myc 是具有激活和抑制双重作用的转录因子，在胃癌的发生及进展中起关键的调控作用［3］。从目前的研究现状来看，国内外罕见贲门胃底癌福尔马林固定石蜡包埋（formaldehyde fixed paraffinembedded，FFPE）组织CIP2A mRNA 水平的回顾性研究，其与HER-2 基因在c-Myc 蛋白共调控方面是否存在着协同作用，未见类似报道。本研究应用半定量RT-PCR 方法检测CIP2A mRNA 表达，荧光原位杂交（FISH）方法检测HER-2 基因扩增，探讨二者及其与各临床病理参数之间的关系，为贲门胃底癌的诊断、治疗和预后提供一定的依据，同时了解CIP2A 的分子调控机制。

1 资料与方法

1.1 标本收集 收集2016年5月至2017年4月间连云港市第一人民医院手术切除的47 例贲门胃底癌石蜡包埋组织，所有病例均为进展期癌，均为RT-PCR 实验成功者（实验均在组织包埋成蜡块的1年内进行）。其中男27 例，女20 例：年龄22～73（中位年龄58）岁。进展期胃癌依据WHO 分类，分为管状腺癌、乳头状腺癌、低分化腺癌（未分化癌）等；分级分3 级，包括高分化、中分化和低分化。本组病例包含管状腺癌22 例，乳头状腺癌3 例，低分化腺癌22 例。贲门胃底癌的临床分期依据2016年10月国际抗癌联盟及美国联合会（UICC∕AJCC）发布的第8 版胃癌TNM 分期法，TNMⅠ期5 例，Ⅱ期14 例，Ⅲ期17 例，Ⅳ期11 例。肿瘤分化程度：高分化7 例，中分化10 例，低分化30例。另选取对应癌旁组织47 例。

1.2 主要试剂及RT-PCR 引物 HER-2 基因扩增FISH 方法检测试剂盒购自广州安比平有限公司；环保脱蜡液购自无锡市江源实业技贸总公司；High Pure Paraffin RNA Isolation Kit 石蜡组织总RNA 提取试剂盒，购自美国Roche 公司；Prime-ScriptTMRT reagent Kit 反转录试剂盒和2×Taq PCR Mastermix 购自TaKaRa 公司；CIP2A 引物序列同文献［4］，并在NCBI 网站进行了BLAST 验证，证实为CIP2A 特异的引物：P1：5′-TACGAATTCATGCGACGGCTGCTGATC-3′（forward）；P2：5′-TACCTCGAGGGAGAAGGCGAACTGTCCGA-3′（reverse），扩增产物307 bp。以β-actin 基因表达产物为内参照设计PCR 引物，序列如下：P1：5′-ATCGTGCGTGACATAAGGAGAAG-3′（forward）；P2：5-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′（reverse），扩增产物197 bp，由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 CIP2A mRNA 提取、扩增及定量 参照以往研究［5-6］FFPE组织中RNA 提取、扩增并加以改进的方法：（1）脱蜡及洗涤：取FFPE组织，切片，每片厚度5 μm，共10 片，放入1.5 mL 无菌EP 管，加入1 mL 环保脱蜡液57 ℃恒温水浴常规脱蜡3 次，100%乙醇洗涤，离心，除上清，共3 次，室温空气干燥。（2）RNA 提取：按照FFPE组织总RNA 试剂盒说明操作提取总RNA，用50 μL 1‰DEPC 水溶解。（3）RNA 质量检测：取1 μL 样本用紫外分光光度计检测吸光值（A值）及浓度（ng∕μL）（确保无DNA和蛋白污染，OD260∕OD280= 2.0±0.2，OD260∕OD230≥1.7）。（4）RT-PCR：采用反转录试剂盒，取1 μg 总RNA 为模板，在10 μL 扩增反应体系中以Oligo dT Primer 为引物，逆转录合成cDNA。取cDNA 2 μg 为模板，在25 μL 扩增反应体系中进行扩增，产物检测采用琼脂糖凝胶电泳法。（5）扩增产物半定量分析：应用GeneSnap 软件系统分析扩增条带。将CIP2A 基因与β-actin 基因扩增条带吸光度的比值（CIP2A∕β-actin）计为CIP2A 基因的相对表达量。

1.3.2 HER-2 基因扩增检测 依照试剂盒提供的标准操作方法，将标本置于全自动组织脱水程序18 h 后石蜡包埋，以4 μm 厚度切片，70 ℃烤片2 h 待用。预处理：新型环保透明脱蜡液脱蜡，水化；置于预热至100 ℃的灭菌纯化水20 min，室温干燥；胃蛋白酶液消化。变性及杂交：吸取10 μL探针液至组织区域，85 ℃变性5 min 37 ℃杂交过夜（12 h）。次日，37 ℃洗液Ⅰ和Ⅱ洗涤，滴加DAPI，封片。避光孵化15～20 min 后，荧光显微镜下观察结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，双变量相关性分析采用非连续变量Spearman 相关性分析。

2 结果

2.1 CIP2A mRNA 在贲门胃底癌及癌旁组织中的转录水平 分析47例贲门胃底癌及其癌旁FFPE组织中CIP2A mRNA 的转录水平，结果显示，贲门胃底癌组织中CIP2A mRNA 的阳性检出率为74.5%（35∕47），高于癌旁组织中的检出率27.7%（13∕47，P=0.000，图1）。根据GeneSnap软件系统分析扩增条带，计算CIP2A mRNA的相对转录水平。t检验结果显示，35例贲门胃底癌组织中CIP2A基因的平均转录水平为0.49±0.09，13 例癌旁组织中平均转录水平为（0.09±0.02），差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 贲门胃底FFPE组织中CIP2A 基因RT-PCR 产物的电泳结果Fig.1 Electrophoresis results of CIP2A gene RT-PCR products in FFPE tissue of cardia-fundal carcinoma

2.2 贲门胃底癌组织中CIP2A mRNA 表达与临床病理特征的关系 笔者采用杨雪等［4］研究中提到的统计学方法，将该组贲门胃底癌病例分为CIP2A mRNA 高转录水平组（≥0.49）22 例和低转录水平组（＜0.49）25 例。结合临床资料，分析CIP2A mRNA 的转录水平与贲门胃底癌临床病理参数之间的相关性。结果显示，CIP2A mRNA 的转录水平与肠型胃癌、较高的分化程度、肿瘤浸润深度、TNM 分期、血管癌栓及神经侵犯相关，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.3 贲门胃底癌组织中HER-2 基因的扩增与临床病理特征的关系 47 例贲门胃底癌患者中，HER-2 基因扩增者9 例，占19.1%（图2）。结合临床资料，分析HER-2 基因扩增与贲门胃底癌临床病理参数之间的相关性。结果显示，HER-2 基因的扩增与肠型胃癌、较高的分化程度及神经侵犯相关，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

图2 贲门胃底癌组织中HER-2 基因扩增Fig2 Amplification of HER-2 in cardia-fundal carcinoma

2.4 贲门胃底癌组织CIP2A mRNA 表达与HER-2 基因扩增的扩增的关系 CIP2A mRNA 与HER-2基因扩增表达呈正相关性（r= 0.410，P= 0.004）。其中CIP2A mRNA 高转录组，CIP2A 阳性表达率36.36%（8∕22）；CIP2A mRNA 低转录组，CIP2A 阳性表达率为4.00%（1∕25，表2）。

表1 贲门胃底癌组织中CIP2A mRNA 表达和HER-2 扩增与临床病理特征的关系Tab.1 Expression of CIP2A mRNA and HER-2 amplification in cardia-fundal carcinoma and its relationship with clinicopathological characteristics

3 讨论

胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，病死率较高。手术切除是目前比较有效的治疗方法，但贲门胃底部癌的生存率依旧很低，因为很多患者在确诊时已失去手术机会。TNM 分期是判断胃癌预后的重要指标，但很多分期相同的患者，预后也出现明显差异［7］。因此，个体化分子靶向治疗是晚期胃癌的重要治疗手段，多基因检测在未来的肿瘤治疗中将成为主流。 CIP2A 是近年被发现的一种新的癌基因，体外实验发现其在维持和促进细胞恶性转化、增殖和体内肿瘤形成方面起关键作用［8-9］。因其能够抑制蛋白磷酸酶2A（PP2A）的磷酸化活性而得名，它通过直接与癌转录因子c-Myc 结合，抑制PP2A 的B56α调节亚基对c-Myc 62 位丝氨酸的脱磷酸化作用，从而稳定c-Myc 蛋白的二元磷酸化结构，抑制其泛素化水解。同时，KHANNA 等［10］在胃癌AGS 细胞、肠型胃癌MKN-28和人纤维肉瘤HT1080 细胞中应用c-Myc RNA 干扰技术后发现CIP2A 蛋白和CIP2A mRNA 表达水平显著降低，说明c-Myc 作为癌转录调节因子可以上调CIP2A 的表达，二者形成了一个正反馈环路。CIP2A 在人体肿瘤乳腺癌［11］、头颈部鳞癌［12］、肝癌［4］、脑胶质瘤［13］、非小细胞肺癌［14］、胃癌［15］等组织中存在高表达，且与肿瘤的恶性临床病理参数和不良预后相关。

表2 贲门胃底癌组织中CIP2A mRNA 表达水平及HER-2基因扩增的关系Tab.2 Relationship between CIP2A mRNA expression and HER-2 gene amplification in cardia-fundal carcinoma例

HER-2 受体是人表皮生长因子受体家族成员之一，定位于人类17q21，蛋白从结构上分为胞外区、跨膜区和胞内区，后者具有酪氨酸激酶活性，与表皮生长因子受体具有同源性。其参与了多种信号通路，主要包括Ras∕MAPK 途径、P13K∕Akt 途径、PLCr 途径和STAT 途径。HER-2 可通过多种途径参与c-Myc 基因表达，其中P13K∕Akt∕mTOR 信号通路最为明确，它可作用于c-Myc mRNA 5′非翻译区（5′UTR）的引导序列（PL2），PL2 含有内部核糖体进入位点（IRES），因而可增强c-Myc mRNA 的蛋白翻译［2］。HER-2 基因扩增可致HER-2 蛋白高表达，导致细胞恶性转化及肿瘤进展见于多数人类恶性肿瘤如乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌等［16］。

c-Myc 是转录因子家族成员之一，具有多个功能域，在转录过程中起到重要的调节作用。c-Myc蛋白的N-端含有转录活化功能域，C-端部位含有亮氨酸拉锁结构和HLH 结构，必要时形成异质二聚体抑制转录。众所周知，c-Myc 表达与细胞增殖状态有关，增殖期c-Myc 高水平表达，休眠期c-Myc低水平表达，这也是恶性肿瘤作为高增殖体高度表达c-Myc 的重要原因。c-Myc 表达水平的调节是相当复杂的，mRNA 和蛋白具有较短的半衰期，受多点调节控制，包括起始、转录延长、翻译和mRNA、蛋白质的加工。CIP2A 和HER-2 作为c-Myc 表达后转录水平调节的典范，二者在c-Myc 调节上是否存在一定的关联。本研究结果显示，贲门胃底癌组织中CIP2AmRNA 与HER-2 基因扩增表达呈正相关性（r=0.410，P=0.004），提示CIP2A和HER-2 在c-Myc 表达后转录水平调节上存在一定的协同作用，HER-2 可通过某种途径上调CIP2A表达。

本研究结果显示贲门胃底癌CIP2A mRNA 阳性检出率为74.5%（35∕47），低于LI 等［8］研究中的CIP2A mRNA 阳性检出率，可能与FFPE组织RNA降解增多和蛋白交联提取率较低相关，但目前的RNA 提取试剂盒对于保存1年内的蜡块还是有较强的临床应用价值的。癌组织CIP2A mRNA 的相对转录水平为0.49，癌旁组织CIP2A mRNA 的相对转录水平为0.09，二者差异有统计学意义，说明CIP2A 作为一种癌基因存在于胃癌组织中；且CIP2A mRNA 过表达与肠型、分化型、较大的TNM分期、较深的浸润深度、癌栓及神经侵犯相关，提示CIP2A 在某些特殊类型的胃癌中高表达，并与肿瘤的侵袭、转移等较差的预后指标相关。与张洪兰等［17］应用免疫组化方法检测贲门胃底癌组织中CIP2A 蛋白表达的研究结论一致，该研究还证实CIP2A 表达与患者的总生存率相关且为独立的预后危险因素，因此检测CIP2A 基因的高表达更有助于贲门胃底癌恶性程度的判断、评估预后和提供准确的治疗靶点。另外，贲门胃底癌HER-2基因扩增者占19.1%（9∕35），HER-2 扩增与肠型胃癌、较高的分化程度及神经侵犯相关，与况丽萍等［18］应用免疫组化方法检测胃癌中HER2 表达的结论一致，提示HER-2 基因扩增与患者较差的预后因素不完全相关，不能作为胃癌患者独立的预后指标，或许HER-2 在对c-Myc 后转录水平和CIP2A 的调节在胃癌发生发展中发挥着更重要的作用。

值得注意的是，本研究发现CIP2A 和HER-2表达呈正相关，二者高表达与贲门胃底癌较高的分化程度和肠型胃癌相关，与LI 等［8］和HER-2 研究全国合作组［19］的研究结论一致，提示二者在肿瘤的去分化中部分丢失，且可能与肠型胃癌特定的细胞亚群相关。这是CIP2A 区别于其他癌基因的两大特点，故笔者推测CIP2A 在贲门胃底癌的发生发展中扮演着一种有异于一般癌基因的角色，同时受到HER-2 基因的正调节，它必将成为一种特殊的肿瘤治疗靶点，同时有研究证实CIP2A高表达还与胃癌患者顺铂耐药相关［20］。