HOXB7 在特发性肺纤维化中抗纤维化的作用

周淼 李风雷 张海龙 孙俊波

1河南中医药大学第三附属医院肺病科（郑州450000）；2河南中医药大学第一临床医学院（郑州450000）；3河南中医药大学第二附属医院中医内科（郑州450000）

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种进行性纤维化的间质性肺炎，发病率高，药物治疗手段有限，预后不良［1］。主要病理特点是Ⅱ型肺泡上皮细胞增生，成纤维细胞积聚和肺实质异常重塑［2］。上皮细胞-间充质转化（EMT）是器官纤维化局灶成纤维细胞的重要来源，有研究表明Ⅱ型肺泡上皮细胞可通过EMT 转化为成纤维细胞，从而参与肺纤维化的病理过程［3-4］。

同源盒基因HOXB7 属于HOX 基因家族B 簇，与肿瘤发生发展关系密切［5］。HOXB7 高表达可促进EMT［6］，还没有相关报道证实其在IPF 中Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT 中的作用。因此，本研究检测HOXB7 对Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT 的作用，首次揭示其在IPF 中扮演的角色及可能的调控机制。另外，有研究表明碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）对EMT 有调节作用且可被HOXB7 调控［7］，因此笔者假设HOXB7 可通过调节bFGF 来调节Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT 过程，从而调控IPF 的发生、发展。

1 材料与方法

1.1 材料 A549 细胞购自美国ATCC 公司；胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素和DMEM 购自美国HyClone 公司；SYBR Premix Ex Taq II 和TRIZOL购自大连宝生物工程有限公司；HOXB7 鼠单抗、bFGF 鼠单抗、E-cadherin 鼠单抗、α-SMA 鼠单抗、COL1A1 鼠单抗、TGF-β1 鼠单抗、GAPDH 鼠单抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购自美国Cell Signaling Technology 公司；BCA 试剂盒购自美国Pierce 公司；Turbofect 购自赛默飞世尔科技公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染后形态学观察 人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549 由含10% FBS，2 mmol∕L L-glutamine，100 U∕mL 青霉素和100 μg∕mL 链霉素的低糖DMEM 培养基于5%CO2、37 ℃条件下培养，细胞融合度达90%传代。传代后细胞生长至70%用无血清培养基培养24 h 使之同步化。随后进行TGF-β1诱导细胞EMT 过程（将TGF-β1 以5 ng∕mL 的 浓度稀释于含0.1% BSA 的无血清DMEM 培养基培养48 h）或细胞转染。细胞分组如下：空白对照（Control组）、TGF-β1 诱导（TGF-β1组）、TGF-β1 诱导48 h 后转染HOXB7 siRNA（β1-HOXB7 si组）、TGF-β1 诱导48 h 后转染non-specific siRNA（β1-non-spe组）。最后，使用倒置相差显微镜观察各组细胞形态改变。

1.2.2 组织采集 6例IPF 患者肺组织作为IPF组，其中男5 例，女1 例，年龄45～67 岁，平均58 岁。另外，对照组为因肺部病变行肺叶切除术，肺标本取自远离病变部位，其中男3 例，女3 例；年龄47～60 岁，平均55 岁。组织立即冷冻。标本均由河南中医药大学第三附属医院提供，患者签署了知情同意书。

1.2.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测［8］TRizol 提取细胞或组织总RNA，利用反转录试剂盒以总RNA为模板合成cDNA，而后以cDNA为模板进行qRT-PCR。反应程序：95 ℃4 min；95 ℃10 s，59 ℃30 s，共40 个循环；72 ℃10 min。HOXB7 引物：Sense primer：5′-AAGTTCGGTTTTCGCTCCAGG-3′；Anti-sense primer：5′-ACACCCCGGAGAGGTTCTG-3′。E-cadherin 引物：Sense primer：5′-TTCTTCGGAGGAGAGCGG-3′；Anti-sense primer：5′-CAATTTCATCGGGATTGGC-3′。α-SMA 引物：Sense primer：5′-CTATGCCTCTGGACGCACAAC-3′；Anti-sense primer：5′ - CCCATCAGGCAACTCGTAACTC - 3′ 。COL1A1 引物：Sense primer：5′-AACGAGATCGAG CTCAGAGG -3′；Anti-sense primer：5′-GGGAGG TCTTGGTGGTTTTG-3′。GAPDH引物：Sense primer：5′-CGTCTTCACCACCATGGAGA- 3′ ；Anti-sense primer：5′-CGGCCATCACGCCACAGTTT-3′。反应体系20 μL，包含10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ。GAPDH 为内参，2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。

1.2.4 免疫印记（Western blot） 收集细胞，裂解提取蛋白质，BCA 试剂盒测定浓度且取25 μg 蛋白质进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转法将蛋白质转移至PVDF 膜。5%脱脂奶粉的Tris Buffered Saline With Tween 溶液室温封闭膜2.5 h，一抗：HOXB7 鼠单抗（1∶800）、bFGF 鼠单抗（1∶700）、E-cadherin 鼠单抗（1∶500）、α-SMA 鼠单抗（1∶500）、COL1A1 鼠单抗（1∶500）、TGF-β1 鼠单抗（1∶700）和GAPDH 鼠单抗（1∶1 000）4 ℃过夜。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗室温孵育1 h，暗室曝光观察结果。GAPDH 为内参对照蛋白。

1.2.5 细胞转染 将A549（3 × 105）接种于6 孔板，37 ℃，5%CO2条件下培养24 h，参照Turbofect操作说明进行转染，将HOXB7 siRNA（5′-GCUAUU GUAAGGUCUUUGUTT-3′，5 μg）、non-specific siRNA（5 μg）分别与6 μL Turbofect 混合，分别加入各孔中。5%CO2条件下转染48 h，后利用qRT-PCR和Western blot 方法检测转染效率。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 进行统计学分析，数值均采用均数±标准差表示。两组均数间比较采用t检验，多组之间采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纤维化组织中HOXB7 表达量升高 为研究纤维化对HOXB7 表达量的影响，利用qRT-PCR 检测纤维化组织HOXB7 的mRNA 表达量。结果表明，纤维化组织HOXB7 mRNA（图1）的表达量是正常组织的2 倍，差异具有统计学意义。

图1 特发性肺纤维化对HOXB7 表达量的影响Fig.1 The effect of IPF on HOXB7 expression

2.2 抑制HOXB7 表达量 为探究HOXB7 对细胞纤维化的作用，首先通过细胞转染HOXB7 siRNA抑制HOXB7，qRT-PCR 和Western blot 分别检测细胞转染后A549 中HOXB7 mRNA 和蛋白表达量的变化。结果表明，β1-HOXB7 si组HOXB7 mRNA（图2A）和蛋白表达量（图2B）较β1-non-spe组显著下调。

2.3 下调HOXB7 抑制细胞纤维化 在HOXB7 抑制的情况下，通过倒置相差显微镜观察HOXB7 对A549 细胞纤维化的影响。结果表明，TGF-β1组细胞形态与control组相比，细胞由鹅卵石形或多角形转变为梭形、细胞间连接变松散，呈间充质细胞形态。而β1-HOXB7 si组细胞形态又转变为鹅卵石形或多角形与control组相同（图3）。

图2 转染后A549 中HOXB7 的表达量变化Fig.2 The change of HOXB7 expression in A549 aftertransfection

图3 转染后A549 形态学变化（×200）Fig.3 Morphological change of A549 after transfection

2.4 下调HOXB7 抑制细胞EMT 过程 为进一步证实HOXB7 对A549 细胞纤维化的作用，检测了抑制HOXB7 对A549 EMT 的标志物分子E-cad、α-SMA 和纤维化标志物COL1A1 表达量的影响。结果显示，与β1-non-spe组相比，β1-HOXB7 si组中，E-cadherin的表达量显著升高，α-SMA 和COL1A1的表达显著降低（图4）。

2.5 HOXB7 通过调节bFGF 来调控细胞EMT为探究HOXB7 对细胞纤维化调控的可能机制，利用Western blot 检测bFGF 蛋白表达量。结果表明，β1-HOXB7 si组中bFGF 的蛋白表达量较β1-non-spe组显著降低（图5A）。为了探究HOXB7 对A549 细胞纤维化的调控作用是否可以通过调控bFGF 来实现，用bFGF（9 ng∕mL）孵育β1-HOXB7 si组细胞5 min，发现E-cadherin 蛋白表达量明显降低，α-SMA 和COL1A1 的蛋白表达量均显著升高（图5B）。

图4 转染后A549 中EMT 标志物和COL1A1 的表达量变化Fig.4 Changes in expression levels of EMT markers and COL1A1 in A549 after transfection

3 讨论

IPF 是弥漫性间质性肺病中的特殊类型，无特效治疗方法，严重威胁人类健康。IPF 共同特点是大量成纤维细胞∕肌成纤维细胞聚集和细胞外基质积聚［9］。成纤维细胞和肌成纤维细胞聚集是肺纤维化重要环节，肌成纤维细胞激活可分泌Ⅰ和Ⅱ胶原蛋白，同时促进α-SMA 的表达［10-11］。Ⅱ型肺泡上皮细胞可通过EMT 转化成肺成纤维细胞∕肌成纤维细胞［12］。在EMT 过程中，上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞并获得迁移能力，上皮细胞标记物E-cadherin 等表达下调，间叶标记物α-SMA 等表达上调［13］。因此，本研究选择E-cadherin 作为上皮细胞标记物，α-SMA 为间叶标记物，可以有效评价EMT 的转化。Ⅰ型胶原蛋白（COL1A1）的表达也是纤维化的标志［14］。本研究通过检测Ⅱ型肺泡上皮细胞A549 的EMT 转化，来评定HOXB7 对肺纤维化的作用。

图5 bFGF 对A549 中EMT 的影响Fig.5 Effect of bFGF on EMT in A549

HOXB7 是胚胎发育时期调控上皮包括肺上皮细胞增殖、分化、迁移的主控基因，而在成体时期，HOXB7 高表达可促进上皮细胞恶性转化［15］。研究表明，HOXB7 的高表达促进结肠癌、口腔癌、黑色素和肺腺癌等多种癌症细胞的增殖和EMT［16］。HUAN 等［17］发现，HOXB7 通过诱导细胞EMT 转化促进乳腺癌细胞迁移。YANG 等［6］发现，HOXB7促进骨肉瘤细胞EMT，从而促进骨肉瘤细胞的增殖和转移。STIEGELBAUER 等［5］报道HOXB7 被miR-196b-5p 抑制后，结肠癌细胞EMT 同样被抑制，从而降低结肠癌细胞转移。然而，对于HOXB7是否对肺纤维化过程中EMT 有影响，目前为止还没有相关报道。SHIMBORI 等［18］表明，TGF-β1 可显著诱导A549 细胞纤维化。本研究发现，IPF组织HOXB7 的表达量显著升高。降低HOXB7 表达量有效抑制TGF-β1 诱导的A549 形态上纤维化转变且抑制EMT 和COL1A1 的表达，说明A549 纤维化被抑制。因此，本研究首次发现HOXB7 在IPF组织中表达量上调，且干扰HOXB7 表达可抑制TGF-β1 诱导的体外培养A549 细胞的纤维化。为IPF 的预防和治疗提供了一定的理论基础，但本研究侧重于对体外培养细胞的研究，所以在后续的实验中可以侧重于体内研究。

有研究［19］表明在口腔癌和乳腺癌细胞中，HOXB7调控bFGF，进而影响癌症发生、发展。bFGF具有促进EMT 的作用，如在晶状体上皮细胞、肝细胞癌细胞、前列腺癌细胞中等［7，20］。因此，笔者假设HOXB7 通过调控bFGF 影响A549 细胞纤维化。本研究，结果表明在TGF-β1 诱导细胞的情况下，降低HOXB7 显著抑制bFGF 表达量，且bFGF 孵育上述抑制HOXB7 的A549 后，显著消除了抑制HOXB7 对细胞EMT 的作用。因此，减少HOXB7 表达量对TGF-β1 诱导的A549 细胞纤维化的抑制作用，可通过调控bFGF 来实现。

综上，本研究发现IPF组织中HOXB7 表达量显著上升，降低HOXB7 显著抑制TGF-β1 诱导的A549 细胞形态学上纤维化的变化，且抑制EMT 和COL1A1 表达。另外。降低HOXB7 可抑制bFGF的表达，且通过调控bFGF 来抑制TGF-β1 诱导的A549 细胞纤维化，为IPF 的防治提供新的潜在靶标和理论基础。