葛根素对酒精诱导的PC12氧化损伤的保护作用*

鲁 洁 王晓丹

(1.泰山医学院第二临床医学院，山东 泰安 271000；2.泰山医学院药学院，山东 泰安 271000)

酒精对神经细胞的损伤，主要通过氧化应激作用诱导其凋亡，造成神经细胞数量减少，中枢神经系统功能受损[1]。目前酒精致神经系统损伤的作用机制并不十分清楚。有学者认为酒精能够代谢产生大量活性氧(ROS)，破坏DNA、脂类、蛋白质和线粒体等细胞器结构，最终导致细胞凋亡或细胞坏死[2]。啮齿类动物模型体内外研究表明，酒精可减少发育中小脑颗粒细胞、海马和皮质神经元的数量，诱发细胞程序性死亡[3]。将不同浓度酒精与去血清培养的PC12细胞接触24 h以上，当酒精浓度达100 mmol/L时，细胞存活率显著下降，并呈浓度依赖性[4]。综上所述，筛选能够抑制或逆转酒精对神经系统损伤的药物具有重要的意义。

本研究利用酒精诱导类神经细胞系PC12损伤，观察葛根素对酒精所致神经损伤的保护效果，并初步探讨其保护机制。

1 药品与材料

1.1 药品与试剂

葛根素，由我院中药学教研室提供，纯度98%以上，用时以DMSO(索莱宝公司)配制成所需浓度。无水酒精，AR，天津市富宇精细化工有限公司；丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要仪器

倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；Infinite200PRO酶标仪，瑞士TECAN公司； CO2培养箱，美国热电公司。

1.3 细胞

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)购自中国科学院上海细胞所，37 ℃，5% CO2常规培养于高糖DMEM培养基，培养基含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。待细胞70%～80%融合时应用于后续实验。

2 实验方法

2.1 MTT法检测细胞存活率

取对数生长期的PC12细胞，以每孔8×104个/ml接种于96孔板，每孔100μl，培养24 h后，将细胞分为对照组、酒精500 mmol/L(根据预试验结果，酒精对PC12细胞的半数致死量为473.25 mmol/L)处理组，葛根素处理组(1 mg/ml、2 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml)，酒精+葛根素处理组(500 mmol/L酒精+0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.8 mg/ml、1 mg/ml)，复孔5个。继续培养24 h，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/mL)， 37 ℃孵育4 h，吸弃培养液，每孔加入DMSO 150 μl，振荡5 min，酶标仪于570 nm处检测吸光度(OD)值。并计算细胞存活率。细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值。

2.2 酶标法检测LDH活性

细胞分组及加药处理同“2.1”项，继续培养24 h。按LDH试剂盒说明书操作，测定450 nm处吸光度值，计算LDH酶活性。

2.3 细胞MDA、SOD、CAT和GSH-Px水平测定

取对数生长期细胞，每孔8×104个/ml接种于6孔板，每孔1 ml，分组及加药处理同“2.1”项，继续培养24 h后离心收集细胞并超声粉碎。将粉碎后细胞按照相关试剂盒说明书操作，紫外分光光度计分别检测A530、A550、A240和A412，计算MDA、SOD、CAT和GSH-Px的含量。

2.4 统计学分析

3 结 果

3.1 对正常PC12细胞存活率的影响

与对照组相比，不同浓度的葛根素对细胞存活率影响不显著，提示单独应用葛根素对PC12细胞的生长影响不明显。结果见表1。

表1 葛根素对正常PC12细胞存活率的影响(n=5)

3.2 对酒精损伤PC12存活率的影响

MTT检测结果显示，单独使用酒精500 mmol/L与细胞接触24 h后，细胞存活率仅为对照组的48.92%；同时加入系列浓度葛根素，随着葛根素浓度升高(0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.8 mg/ml、1 mg/ml)，细胞存活率分别为51.54%，56.02%，59.11%，67.59%，76.42%。与酒精处理组相比，差异显著。结果见表2。

表2 葛根素对酒精损伤PC12细胞存活率的影响(n=5)

注：与对照组比较，**P<0.01；与酒精干预组相比，▲P<0.05。

3.3 对酒精损伤后LDH活性的影响

对酒精损伤后培养上清中LDH活性检测结果显示，500 mmol/L酒精接触细胞24 h，培养上清中LDH活性明显增高，同时加入系列浓度葛根素后，细胞培养上清中LDH活性与酒精处理组相比明显降低。提示葛根素降低胞内LDH释放，明显减少酒精诱导的PC12细胞死亡。结果见表3。

表3 葛根素对酒精损伤PC12细胞LDH活性的影响

注：与对照组比较，**P<0.01；与酒精干预组相比，▲P<0.05,▲▲P<0.01。

3.4 对酒精损伤后PC12细胞MDA、SOD、CAT和GSH-Px水平的影响

与对照组相比，与500 mmol/L酒精接触的PC12细胞中MDA含量明显升高，而SOD、CAT及GSH-Px活性显著降低。同时加入葛根素后，MDA水平呈现不同程度降低，与此同时SOD、CAT及GSH-Px活性显著升高。结果见表4。

表4 葛根素对酒精损伤PC12细胞MDA、SOD、CAT和GSH-Px水平的影响(n=5)

注：与对照组比较，**P<0.01；与酒精干预组相比，▲P<0.05,▲▲P<0.01。

4 讨 论

PC12细胞具有与神经元类似的生长特性，是一种类神经元细胞系，常用于神经退行性疾病的药物筛选、疗效评价及相关机制研究。MTT实验结果显示，不同浓度葛根素对正常PC12细胞存活率影响不显著。将其作用于500 mmol/L酒精损伤的PC12细胞时，0.1mg/ml葛根素即能够显著抑制细胞损伤，并且这种保护作用在实验浓度范围内随葛根素浓度的增加而增强，说明葛根素对酒精所致PC12细胞损伤具有保护作用。LDH检测结果也进一步证实了这种保护作用。

酒精及其代谢产物通过某些细胞因子的释放能够导致细胞线粒体受损、内质网应激，并释放大量羟自由基、超氧阴离子和过氧化氢等，氧化应激造成细胞膜脂质过氧化[5-6]，细胞内各种抗氧化酶活性降低[7]，最终导致细胞凋亡。本实验结果显示酒精导致PC 12细胞抗氧化酶SOD, CAT和GSH-Px活性显著下降。但用0.1 mg/ml浓度的葛根素处理后，细胞膜脂类氧化成分MDA的量有效降低，细胞SOD， CAT和GSH-Px活性显著升高，提示葛根素可能通过提高细胞抗氧化酶的活性，减少MDA释放，减缓细胞进入凋亡程序。说明葛根素对酒精所致类神经细胞损伤具有潜在的预防和治疗作用。