肺癌患者化疗前后血浆let-7a表达水平与化疗药物疗效相关性分析

彭微 刘洁 袁桂

412000湖南中医药高等专科学校基础医学部，湖南株洲

因肺癌早期症状不明显，常常被患者忽略。近年来肺癌在我国发病率和死亡率呈逐年上升趋势，是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。目前，由于肺癌早期诊断率低，多数肺癌患者发现时已丧失手术机会，化疗成为肺癌晚期患者最主要治疗手段。因此肺癌晚期患者生存率及预后取决于对其化疗药物的敏感性。因此，提高晚期肺癌患者化疗疗效是目前临床关注的重点问题。MicroRNA是近年发现的一类单链小分子RNA，对其的研究已成为一个新的热点。最近的研究发现，1et-7a 在细胞内影响着基因的表达调控，在疾病发生中具有重要的作用，尤其是在肿瘤的发展过程中，let-7a扮演着不可替代的角色。目前有大量研究显示，miRNAs和肿瘤的发生发展有密切关系，提示其可能是一种新型肿瘤标记物。因此深入研究miRNAs和肺癌发病机制的关系，有可能为肺癌的诊治提供新靶点[1]。let-7a 是第一个被报道与肺癌相关的miRNA，近年来越来越多研究表明，let-7a的表达水平在肿瘤细胞对化疗敏感性中起一定调节作用。Let-7a在肿瘤细胞与正常细胞中存在明显差异，因此let-7a 在肿瘤早期诊断方面可能有重要意义。研究证实，let-7a参与细胞分化、增殖和凋亡、个体发育、机体代谢以及病毒感染等过程，并且在多种肿瘤中扮演重要的角色。Let-7a 的表达水平在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中显著下调，而且肺癌和乳腺癌中let-7a 的表达水平与患者的生存时间呈正相关。因此，本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测肺癌晚期患者化疗前后let-7a 水平变化，并观察其与顺铂联合5-Fu/CF 化疗方案疗效的关系，为逆转化疗药物耐药提供新的治疗靶点，为指导临床化疗用药提供理论依据。

资料与方法

选取晚期肺癌患者60例，所有患者术前均未接受过放化疗及细胞分子靶向等任何治疗，所有患者均签署知情同意书。

方法：入院后1次/2周重复顺铂联合5-Fu/CF 化疗方案治疗，6 个化疗周期后进行疗效评估。并采集60例患者化疗前后外周血。①血浆标本采集：抽取化疗前患者清晨空腹外周静脉血5 mL，6 个化疗周期后再抽取1次，血浆加入EDTA抗凝剂，常温下4 h内处理。4℃下1 200 r/min 离心10 min，血浆和血细胞分别用1.5 mL 无RNase 的离心管分装，-80℃冰箱保存备用。②血浆总RNA 提取：将400 μL 血标本 血浆移至1.5 mL 的EP 管中，4℃，1 200 r/min，离心10 min。离心后收集血浆至另一新的EP管中。加入Trizol试剂，Trizol试剂∶血浆比例为1∶0.8。混合均匀，继续离心处理。取上层清液。测定RNA 浓度和纯度。③血浆let-7a检测：按照上海吉玛制药技术有限公司 Hairpin-itTM miRNAs qPCR QuantitationKit 试剂盒说明进行qRT-PCR操作。按照通用反转录条件进行转录，95℃30 s，95℃10 s，55℃15 s，72℃20 s，循环40次，每个样本重复3次。另外扩增β-actin作为内参基因。

疗效评价标准：疗效评定参照《实体瘤疗效评定标准》进行[2]，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)。总有效率(RR)=(CR+PR)/总例数×100%。4 周后，CR 或PR 者行CT复查进行疗效确认。

统计学处理：数据应用SPSS 15.0 软件处理；计量资料以(±s)表示，采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

患者化疗前后血浆let-7a 表达情况比较：60例患者化疗后血浆let-7a 表达水平为(2.09±0.37)，显著低于化疗前水平(4.29±0.45)，差异有统计学意义(P=0.019 6，P＜0.05)。

let-7a的表达与化疗药物疗效相关性分析：顺铂联合5-Fu/CF 化疗方案治疗后，对60例肺癌晚期患者进行疗效评估，结果显示，化疗前血浆let-7a 在(CR+PR)组的表达量为(2.60±0.47)，明显低于(PD+SD)组的(4.92±0.50)，差异有统计学意义(P=0.021 3，P＜0.05)。由此证明，血浆let-7a 的表达有可能与化疗药物疗效存在相关性。抑制let-7a 的表达可以增加患者对化疗药物的敏感性。而let-7a高表达也可提示对铂类药物化疗的抵抗。

讨 论

肺癌患者早期主要表现为咳嗽、咳血、胸痛、胸闷气短、贫血等症状，病情易被掩盖或忽略。肺癌患者发现往往病情已进展至晚期，具有较高死亡率。对于此类患者，临床通常多采用化疗方法治疗。然而多数化疗药物在杀伤肿瘤细胞时，化疗药物细胞毒作用的无选择性和对宿主全身不良反应限制了疗效的提高，从而使化疗不能顺利进行[3]。因此，如何提高肿瘤对化疗药物的敏感性，增加化疗药物疗效，已成为临床关注重点，同时也是提高肺癌晚期患者生存率的关键。

Let-7a 作为一种抑癌基因在肺癌、乳腺癌、前列腺癌中表达显著下调。Let-7a靶向抑制c-Myc，使c-Myc所激活的细胞增殖信号通路失活。K-Ras 是信号通路EGFR/RAS/MAPK 中的关键分子，对肿瘤细胞增殖、迁移中发挥重要作用。

Let-7a 可以通过下调k-RAS 及HMGA2 基因的表达，抑制肺癌细胞的侵袭及增殖。研究证实Let-7 低表达的肺癌患者复发时间短，预后不良。将Let-7a 构建到A549 肺癌细胞株中，通过皮下种植、尾静脉注射接种小鼠体内，结果发现let-7a 能抑制肺癌的生长及转移。

Sorrentino 等[4]研究表明let-7 家族的异常表达可以影响肿瘤对紫杉醇、阿霉素等化疗药物的敏感性。Chang 等[5]研究显示let-7g 表达水平与使用顺铂联合5-FU 或希罗达(CF)的晚期胃癌患者从治疗到进展时间(TTP)呈正相关。Yang等[6]发现在接受含铂类化疗方案的患者中，化疗耐药患者肿瘤组织中的let-7i 表达显著下降，进一步的体外实验证实let-7i与卵巢癌细胞对顺铂的耐药相关。Liu等[7]研究发现let-7i 的低表达与接受奥沙利铂+亚叶酸钙+5-FU(FOLFOX4)新辅助化疗的不良病理缓解及预后相关。魏彦玲等[8]发现let-7f 在胃癌阿霉素耐药细胞株SGC7901/ADR 中的表达显著降低，逆转let-7f 表达可增加其对阿霉素耐药性。

顺铂是肺癌治疗中非常经典的化疗药物，已被广泛用于治疗肺癌。目前临床主要采用顺铂联合5-Fu/CF 化疗方案。国内外临床研究显示，顺铂联合5-Fu/CF化疗方案复发率较低，能够显著提高患者生存率，具有较好临床效果[9]。本研究以我院收治肺癌晚期患者60例为研究对象，检测其化疗前、后血浆let-7a的表达变化，分析let-7a 水平与化疗药物疗效的相关性。结果显示，肺癌晚期患者化疗后let-7a 水平明显低于化疗前，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明顺铂联合5-Fu/CF 化疗方案能够影响let-7a 的表达水平，提示顺铂联合5-Fu/CF 化疗方案可能通过降低血浆中let-7a的表达来抑制肿瘤的发展。与此同时，(CR+PR)患者血浆中let-7a 表达低于(SD+PD)，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示血浆let-7a 的表达可能与化疗药物的疗效存在相关性。说明，血浆let-7a 有可能成为预测化疗药物疗效的潜在性生物指标。