益气活血方治疗破裂型腰椎间盘突出症的机理研究

周孝文 刘锦涛 俞 峰

江苏省苏州市中医医院骨伤科 215003

腰椎间盘突出症是引起腰腿疼痛常见疾病之一，部分患者存在突出组织重吸收现象，为此国内外学者进行了大量相关研究，现有研究表明P38MAPK信号通路与机体炎症反应关系密切，为探讨益气活血方与该通路在突出组织重吸收方面的关系，进行了本次实验。

1 材料与方法

1.1 实验材料 P38MAPK特异性阻断剂：SB203580，SelleckChemicals公司，No:S1076。中药益气活血方(苏州市中医医院药剂科提供)组成：生炙黄芪20g、威灵仙10g、川芎15g、木瓜10g、地龙15g、防己10g、当归10g、白芥子6g、水蛭6g。置于500ml常温水中浸泡30min，煎煮(火力2 100W)开锅后煎30min取汁200ml；再加水300ml煎30min取汁200ml两次相兑并浓缩成1.5g/ml煎剂保存于恒温冰箱中。

1.2 实验室动物 选择3月龄SPF级Sprague-Dawlay(SD)雌性大鼠80只，由上海Slac实验动物有限责任公司(中科院上海分院)提供，合格证号：SCXX(沪)2015-0005。

1.3 动物造模 以盐酸氯胺酮(0.10g/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠，去除背部体毛，橡皮筋扎住尾巴根部，常规消毒，每只大鼠切取第3、4尾椎椎间盘(包含上下软骨终板)。用10ml注射器针头刺破所取椎间盘正中纤维环暴露髓核，用电子天平(万分之一单位)称其重量，游标卡尺测量体积。碘伏常规消毒背部，后正中线切开皮肤、肌肉、将取出的椎间盘植入肌肉层，随后逐层缝合，红霉素眼膏涂擦切口，造模成功后将大鼠放入笼中常规饲养。

1.4 分组 选择80只3月龄SD雌性大鼠，制作破裂型椎间盘突出模型，采用完全随机实验设计分为破裂模型组(对照组)、中药组、P38阻断剂组和P38阻断剂+中药组四组，每组20只。

1.5 干预方法 于造模后第2天，各组均以9.1ml/kg剂量1次/d进行灌喂；对照组予生理盐水灌喂+鞘管内注射2% DMSO(10mg/kg)；中药组予益气活血方煎液灌喂+鞘管内注射2% DMSO(10mg/kg)；P38阻断剂组予生理盐水灌喂+鞘管内注射P38MAPK的阻断剂 SB203580(10mg/kg)；中药+P38阻断剂组予益气活血方煎液灌喂+鞘管内注射P38MAPK的阻断剂 SB203580(10mg/kg)；1次/d，直至取材之日。

1.6 取材与处理 造模结束后正常饲养，于1周和4周后各组分别取10只大鼠，将其麻醉，沿原手术切口打开背部肌肉，逐层分离组织，找到包埋的椎间盘，取出后迅速用电子天平称重、游标卡尺测量直径及高度。测量完毕后将椎间盘分为2份分别标号：一份放入10%的中性甲醛固定液中进行固定24h，预留做石蜡标本。另一份用0.01mmol/L PBS磷酸缓冲盐溶液洗去血渍后放入已标记的无菌EP管中，于-80℃冰箱中保存。预留用于Real Time PCR、Western Blot等检测。

1.7 检测指标 分别以电子天平、游标卡尺测量椎间盘质量(g)和体积(mm3)，采用Real Time PCR检测血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF) 、肿瘤坏死因子-α(Tumour necrosis factor-α) 、白介素-1β(Interleukin-1β)、金属基质蛋白酶-3(Matrix metallo proteinases-3)、金属基质蛋白酶-9(Matrix metallo proteinases-9)及P38MAPK的mRNA表达，以蛋白质印记法(Western Blot)检测P38MAPK、P-p38MAPK、TNF-α、IL-1β、VEGF、MMP-3、MMP-9的蛋白表达。质量、体积差计算方法:1周(mg)=造模前(mg)-造模后1周(mg)；4周(mg)=造模前(mg)-造模后4周(mg)。1周(mm3)=造模前(mm3)-造模后1周(mm3)；4周(mm3)=造模前(mm3)-造模后4周(mm3)。

1.8 统计学方法 采用SPSS16.0软件对所得数据进行分析，计量资料用(x±s)表示，正态分布用t检验，两组间差异采用独立样本t检验，组间差异采用单因素方差分析；不符合正态分布使用秩和检验；P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

2 实验结果

2.1 椎间盘质量、体积变化 各组椎间盘质量和体积变化比较：1周末，中药组质量、体积减少值明显高于其他组，P38阻断剂组各时间段质量减少值小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。4周末，中药组质量、体积减少最明显，P38阻断剂组、中药+P38阻断剂组体积减少值小于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组椎间盘质量和体积变化比较(x±s)

注：与对照组比，*P<0.05，**P<0.01；与中药+P38阻断剂组比，※P<0.05，※※P<0.01。与1周末相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 椎间盘HE染色 (1)对照组：纤维环细胞排列紊乱，髓核细胞减少、体积缩小，胶原纤维组织甚至消失，部分细胞间质消失，形状不规则。(2)中药组：髓核细胞减少，细胞核聚集，体积缩小；部分细胞间质消失，形状不规则，呈胶冻样改变，部分可见有血管组织浸润。(3)P38阻断剂组：髓核位于中心，髓核细胞散在排列，周围是网状胶原纤维；大量胶原纤维细胞呈长梭形，细胞核深染，长柱状。(4)中药+P38阻断剂组：髓核细胞散在排列，胶原纤维呈网状排列在髓核区周围，纤维环细胞为长梭形，纤维环区围绕在髓核区外周。见图1。

2.3 Real Time PCR检测椎间盘髓核细胞TNF-α、IL-1β、VEGF、MMP-3、MMP-9及P38MAPK的mRNA表达 (1)对照组：在1周末和4周末VEGF、TNF-α、IL-1β、MMP-3、MMP-9、P38MAPK、P-p38MAPK的蛋白均有一定程度表达；均低于中药组，高于P38阻断剂组，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)中药组：在1和4周末，TNF-α、IL-1β、VEGF、P38MAPK、MMP-3、MMP-9的mRNA表达均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；4周末，TNF-α、VEGF、MMP-3的mRNA表达均高于1周末，而MMP-9的mRNA表达低于1周末，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；4周末，IL-1β、P38MAPK的mRNA表达低于1周末，差异无统计学意义(P>0.05)。(3)P38阻断剂组：TNF-α、P38MAPK、MMP-3，在1周末的mRNA表达均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；4周末，TNF-α、VEGF、P38MAPK、MMP-3、MMP-9的mRNA表达均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；4周末，TNF-α、VEGF、MMP-3的mRNA表达低于1周末，差异有统计学意义(P<0.05)。(4)中药+P38阻断剂组：1周末，除TNF-α的mRNA表达明显低于对照组外，余指标差异无统计学意义(P>0.05)；4周末，TNF-α、IL-1β、VEGF、P38MAPK、MMP-9的mRNA表达均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

中药组4周 P38阻断剂组4周

图1中药组、P38阻断剂组4周椎间盘HE染色

2.4 Western Blot检测TNF-α、IL-1β、VEGF、MMP-3、MMP-9、P-p38MAPK、P38MAPK的蛋白表达 见图2。(1)对照组：VEGF、TNF-α、IL-1β、MMP-3、MMP-9及P38MAPK、P-p38MAPK的蛋白均有一定程度的表达；1周末和4周末均低于中药组，而高于P38阻断剂组，差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)中药组：在1周末，MMP-3、MMP-9、TNF-α、IL-1β及P-p38MAPK的蛋白表达明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)； 4周末，VEGF、MMP-3、MMP-9、TNF-α、P38MAPK、P-p38MAPK的蛋白表达明显高于对照组和中药+P38阻断剂组，差异有统计学意义(P<0.05)。(3)P38阻断剂组：在1周末，VEGF、MMP-3、MMP-9、P38MAPK及P-p38MAPK的蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)；4周末，TNF-α、P38MAPK、P-p38MAPK的蛋白表达明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。(4)中药+P38阻断剂组：在1周末，TNF-α、IL-1β、VEGF、MMP-3、MMP-9、P-p38MAPK、P38MAPK的蛋白表达均低于中药组(P<0.05)；4周末，TNF-α、VEGF、MMP-3、MMP-9、P-p38MAPK、P38MAPK的蛋白表达均低于中药组(P<0.05，P<0.01)。

图2 不同时段各组TNF-α、IL-1β、P38MAPK、P-p38MAPK、VEGF、MMP-3、MMP-9 的蛋白表达

3 讨论

3.1 P38MAPK信号通路 Brewster等[1]首先提出P38MAPK的概念，“T-G-Y”三肽序列是其基本结构“G”代表甘氨酸残基，“T”代表苏氨酸，“Y”代表酪氨酸。“T”和“Y”双位点的同时磷酸化才能激活MAPKs通路[2-3]。P38MAPK在椎间盘退变中起到炎症介质聚集作用，可以调控多种细胞因子和转录因子，介导中性粒细胞的活化，炎症因子与P38MAPK通路的激活可相互形成正反馈，其中细胞因子IL-1β可释放细胞外刺激信号对P38MAPK信号通路进行激活，并能够促进椎间盘蛋白多糖降解并抑制其合成，参与椎间盘炎症反应[3-4]。Rebecca等[5]认为致炎因子的表达可能受P38MAPK信号传导通路的调控，而P38MAPK的磷酸化是人椎间盘退变的重要机制之一。P38MAPK信号传导通路可以通过调控VEGF的表达参与椎间盘的退变。P38MAPK信号通路可被多种物理和化学因素、炎性因子或应激刺激激活，进而调节多种转录因子的基因表达活性，VEGF可加速趋化因子募集炎性细胞向椎间盘突出部位聚集发生吞噬；又能直接刺激血管内皮细胞的分裂增殖，有利于重吸收[6-7]。有学者认为P38MAPK阻断剂可抑制P38MAPK的磷酸化，缓解椎间盘的退变进程[8]。

3.2 益气活血方与重吸收 腰椎间盘突出症属中医“痹证”范畴。本方以《医林改错》补阳还五汤、《金匮要略》防己黄芪汤为基础，加减化裁成“益气活血方”以达益气行血、化淤除湿、通经活络之功。“防己黄芪汤”主补正气，祛水湿；现代药理研究表明防己黄芪汤有利于缓解神经根水肿，减轻下肢放射症状[9]。“补阳还五汤”补气、活血、通络，减轻缺血再灌注损伤[10]，利于恢复神经功能[11]。方中生炙黄芪为君，炙黄芪补气行血；生黄芪走表利水；黄芪多糖可提高机体的免疫功能以扶正[12]。防己祛风除湿、利水消肿；当归补血活血，祛淤不伤正。白芥子长于温化寒痰，与防己、当归共为臣药；三者均具有抗炎镇痛作用，其中防己对全身各部位急、慢性炎症均可起到抑制作用[13-15]。川芎行气活血止痛，助当归活血祛淤，还具有镇痛、神经系统保护作用[16]。白术健脾除湿，木瓜祛湿通络，且酸能软坚散结，同助黄芪利水；木瓜、白术均具有抗炎、免疫调节作用[17-18]，威灵仙通络止痛、消骨鲠；也可镇痛抗炎、利尿消肿[19]。本方注重利水湿，用炒白术以增其燥湿健脾之功，与防己合用增强利水消肿之功。威灵仙消骨鲠，对突出的髓核也具有一定消融作用。水蛭、地龙善散结通络，共为佐药。综合全方，正气盛，水湿除，淤血消，在一定程度达到重吸收的目的[20]。

3.3 益气活血方与P38MAPK信号通路 突出椎间盘自然吸收主要与突出组织的新生血管、炎性细胞的吞噬、诱发自身免疫反应，基质的合成和降解失衡等密切相关[21]。通过现有研究得知P38MAPK信号通路参与新生血管的形成、炎性反应的激活等过程当中，本实验中中药组结果明显优于对照组、P38MAPK阻断剂组，说明益气活血方可激活P38MAPK信号通路，促进突出组织重吸收的作用。

重吸收发生的机制学说众多，本实验只是从一方面进行研究，阐述了其存在的可能性，但本实验存在诸多不足之处，希望通过后续研究，对突出椎间盘重吸收的机制能有更清楚的认识。