羊蹄甲果荚总黄酮提取工艺优化及抗氧化性研究

张鹏 张蝶 唐森

摘      要：以羊蹄甲果荚为原料，乙醇为提取溶剂，通过单因素和正交试验对回流提取羊蹄甲果荚总黄酮工艺进行优化;并通过考察羊蹄甲果荚总黄酮对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）和羟基自由基（·OH）的清除能力来评价其抗氧化性。结果表明，羊蹄甲果荚总黄酮的最佳提取工艺参数为：提取时间5 h、料液比1∶30 （g∶mL）、提取温度80 ℃、乙醇体积分数80%。在此优化工艺条件下，提取液中总黄酮含量为10.837 mg·g-1。羊蹄甲果荚总黄酮对DPPH自由基（IC50=34.511μg·mL-1）和羟基自由基（IC50=0.090 mg·mL-1）具有一定的清除作用，表明其具有一定的体外抗氧化活性。

关  键  词：羊蹄甲;总黄酮;正交试验;提取工艺;抗氧化性

中图分类号：R 284.2       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）12-2717-07

Abstract： Using mature seedpods of Bauhinia purpurea as raw material， and ethanol as extracting solvent， based on the results of single factor tests， the conditions of reflux extraction of total flavonoids in seedpods of Bauhinia purpurea were optimized by orthogonal tests.The antioxidant activity of total flavonoids from seedpods of Bauhinia purpurea were evaluated by investigating its scavenging capacity for 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH·） and hydroxyl free radical（·OH）. The best extraction process parameters of total flavonoids were determined as follows： the ethanol concentration 80%， the extraction temperature 80 ℃， the ratio of solid to liquid 1：30，the extraction time 5 h.Under these extraction conditions， the contents of total flavonoids in the extract was 10.837 mg·g-1.The antioxidant tests results indicated that scavenging capacity （IC50） of total flavonoids towards DPPH· and ·OH were 34.511 μg·mL-1 and 0.090 mg·mL-1， respectively， which indicated that the total flavonoids had strong antioxidant activity.

Key words： Bauhinia purpurea; Total flavonoids; Orthogonal test; Extraction process; Antioxidant activity

黄酮类化合物（flavonoids）是以2-苯基色原酮为基本母核而衍生成的一类天然有机物质，以C6-C3-C6为基本骨架，广泛存在于自然界植物组织中的次生代谢产物[1]。现代药理研究结果表明黄酮类物质在预防心脑血管疾病、老年性痴呆等方面有明显疗效，还有治疗腹泻、抗炎症、抗真菌、抗肿瘤、保护肝脏、治疗糖尿病、增强身体免疫力、消除自由基等功效，且毒性较低[2]，因此可作为天然添加剂，用于食品、保健品和化妆品等生产领域。

羊蹄甲（Bauhinia purpurea）隶属于豆科（Leguminosae）、羊蹄甲属（Bauhinia），是广泛栽培于我国华南地区的园林绿化喬木植物[3]。羊蹄甲的花朵、叶子、茎秆和树根均可入药，具有健脾祛湿和止血等功效，常用于医治消化不良、急性胃肠炎、肝炎、咳嗽咯血、关节疼痛、跌打损伤等疾病[4]。羊蹄甲果荚是收获羊蹄甲种子后的剩余废弃物，常被作为垃圾来焚烧处理或于自然环境中慢慢分解，造成该生物质资源的浪费。研究结果表明，同属于豆科的一些植物的果荚中含有丰富的黄酮类物质[5-12]，而关于羊蹄甲果荚总黄酮的提取工艺及抗氧化性研究却鲜有报道。因此，研究羊蹄甲果荚总黄酮的提取及生物活性，对提高羊蹄甲资源的综合利用具有十分重要的意义。

本研究以羊蹄甲果荚为试验材料，基于单因素试验的结果，采用正交试验设计优化羊蹄甲果荚总黄酮的提取工艺条件;同时，选取L-抗坏血酸（Vc）为阳性对照药，以羊蹄甲果荚总黄酮对DPPH自由基和羟基自由基的清除活性来评价其体外抗氧化活性。以期为羊蹄甲果荚黄酮类物质的进一步研究及其在医药工业等方面的应用提供科学依据。

1  实验部分

1.1  材料与试剂

羊蹄甲果荚：采自广西科技师范学院校园内，为8至9月份种子成熟后的褐色果荚，去除种子，将果荚洗净后置于45 ℃的恒温鼓风干燥箱内干燥，粉碎后过80目筛，粉末装密封袋置于阴凉干燥处储存备用;芦丁标准品（纯度≥98%，批号：F8525，山东西亚化学服务有限公司）;无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、石油醚、氢氧化钠、L-抗坏血酸、水杨酸、七水合硫酸亚铁均为国产分析纯，30%过氧化氢，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）[凯玛生化（天津）有限公司]，所用水均为蒸馏水。

1.2  仪器与设备

FW177 中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）;GZX-GF101-3BS 电热鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）;UV-2600 岛津紫外可见分光光度计[岛津企业管理（中国）有限公司];HH-S4 数显恒温水浴锅（金坛市医疗器械厂）;SHZ-D（Ⅲ） 循环水多用真空泵（巩义市科瑞仪器有限公司）;R-1001VN 旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）;KQ-300DB 数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）;FA-2004B 电子天平（上海越平科学仪器有限公司）。

1.3  试验方法

1.3.1  总黄酮提取工艺流程

羊蹄甲果荚→45 ℃烘干→粉碎→过80目筛→石油醚（沸程30 ～ 60 ℃）脱脂→挥干溶剂→称量（2 g）→回流提取→抽滤→减压浓缩→总黄酮提取液。

1.3.2  芦丁标准曲线的绘制

采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法测定总黄酮含量[6，13]。准确称取纯度为≥98%的芦丁标准品50 mg，置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液溶解并定容至50 mL刻度线，从而得到浓度为1.0 mg·mL-1的芦丁标准品溶液。分别精密移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL芦丁标准品溶液于10 mL具塞刻度试管中（将9支具塞刻度试管依次编号为0至9号管），每管分别加入0.5 mL质量体积分数为5%的NaNO2溶液，充分摇匀并静置6 min，再向每管分别加入质量体积分数10%的Al（NO3）3溶液0.5 mL，充分摇匀并静置6 min，再向每管分别加入4.0 mL质量体积分数4% NaOH溶液，然后用蒸馏水将每管定容至10 mL刻度线，充分摇匀并静置15 min。

以0号具塞刻度试管为空白对照组，用分光光度计在最大吸收波长510 nm处分别测定0至9号管芦丁溶液的吸光度值。以芦丁质量浓度（C）为横坐标，与其相对应的吸光度值（A）为纵坐标用统计学软件做散点图，通过线性回归拟合得到芦丁质量浓度C（mg·mL-1）與溶液吸光度值A之间的线性回归方程为A=11.505C-0.011 9，相关系数R2=0.999 8。表明芦丁标准样品浓度在0.010 ～ 0.080 mg·mL-1范围内与吸光度值呈良好的线性关系。

1.3.3  提取液总黄酮含量的测定

1.3.4  单因素试验

以提取液中总黄酮含量为试验指标，分别考察提取时间、料液比、提取温度、乙醇体积分数4个单因素对羊蹄甲果荚总黄酮提取效果的影响：（1）准确称取羊蹄甲果荚粉末2.0 g，固定乙醇体积分数为70%，料液比为1∶30 （g∶mL），提取温度为70℃，考察回流提取时间分别为1、2、3、4、5、6 h的条件下提取液中总黄酮含量的差异;（2）准确称取羊蹄甲果荚粉末2.0 g，固体乙醇体积分数70%，提取温度70℃，提取时间4 h，考察料液比分别为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 （g∶mL）的条件下提取液中总黄酮含量的差异;（3）准确称取羊蹄甲果荚粉末2.0 g，固定乙醇体积分数70%，料液比1∶30 （g∶mL），提取时间4 h，考察回流提取温度分别为40、50、60、70、80、90℃的条件下提取液中总黄酮含量的差异;（4）准确称取羊蹄甲果荚粉末2.0 g，固定料液比为1∶30 （g∶mL），提取温度70℃，提取时间4 h，考察乙醇体积分数分别为40、50、60、70、80、90%的条件下提取液中总黄酮含量的差异。

1.3.5  正交试验

在单因素试验基础上，以羊蹄甲果荚总黄酮含量为试验指标，以提取时间（A）、料液比（B）、提取温度（C）、乙醇体积分数（D）为试验考察因素，用L9（34）标准正交试验设计表寻求羊蹄甲果荚总黄酮最优提取工艺参数，正交试验方案的试验因素及水平设置见表1。

1.3.6  总黄酮抗氧化活性测定

（1）DPPH自由基清除活性[14，15]

DPPH·一般在无水乙醇或乙醇-水溶液中可处于相对稳定的状态，其化学结构中所存在的孤对电子在可见光区517 nm处有强烈的光谱吸收。具有DPPH·清除能力的物质可以与DPPH·结构中的孤对电子进行配对结合，将稳定的DPPH·转化为黄色的DPPH，从而使溶液在波长517 nm处的光谱吸收减弱，甚至消失。因此通过测定光谱吸收减弱的程度可以间接判定被测物质的DPPH·清除能力。

准确称取19.7 mg DPPH，用无水乙醇溶解定容于250 mL容量瓶中，配制成浓度为0.2 mmol·L-1 DPPH工作液。取不同浓度梯度的总黄酮溶液2 mL分别加入10 mL具塞刻度试管中，再向每管加入0.2 mmol·L-1 DPPH工作液2 mL，摇匀后放于阴暗处静置30 min，然后在517 nm处分别测定上述溶液的吸光度值，记为A1;另取2 mL不同浓度梯度的总黄酮溶液与无水乙醇2 mL置于10 mL具塞刻度试管中，摇匀，避光静置30 min后在517 nm处测定吸光度值，记为A2;取0.2 mmol·L-1 DPPH溶液2 mL与无水乙醇2 mL置于具塞试管中，摇匀，放阴暗处30 min后在517 nm处测定吸光度值，记为A0。用无水乙醇作参比，以Vc为阳性对照进行相同实验。取3次平行实验测定的平均值。以测试样品浓度为自变量，DPPH·清除率为因变量做散点图并进行线性拟合，计算IC50值。定义IC50值为自由基清除率为50%时样品的浓度，浓度越低，表明该样品的抗氧化性越强[16]。DPPH自由基清除率计算公式如下：

（2）羟基自由基清除活性[17]

Fenton反应产生·OH与水杨酸反应生成在可见光区510 nm处有强烈光谱吸收的有色化合物2，3-二羟基苯甲酸。如果向溶液中加入的待测物质具有清除·OH能力，就会减少2，3-二羟基苯甲酸的生成，从而使吸收减弱，甚至消失，因此测定溶液在510 nm处光谱吸收减弱的程度可以反映被测物质的·OH清除能力。

精确称取固体FeSO4 0.1390 g，用蒸馏水溶解后定容至50 mL容量瓶，制备成浓度为10 mmol·L-1的FeSO4溶液。精确称取水杨酸0.0691 g，用无水乙醇溶解后定容至50 mL容量瓶，制备成浓度为10 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液。精确量取30% H2O2溶液0.045 mL置于50 mL的容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度，得浓度为8.8 mmol·L-1 H2O2溶液。移取不同浓度梯度的黄酮溶液1 mL于10 mL具塞刻度试管中，依次分别加入10 mmol·L-1 FeSO4溶液1 mL、10 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液1 mL、8.8 mmol·L-1過氧化氢溶液1 mL，在37 ℃水浴中反应30 min，以蒸馏水为参比在510 nm处测定溶液吸光度值，记为A1;另取成浓度梯度总黄酮溶液1 mL于10 mL具塞刻度试管中，依次分别加入10 mmol·L-1FeSO4溶液1 mL、10 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液1 mL和蒸馏水1 mL，在37 ℃水浴中反应30min，在510 nm处测定溶液吸光度值，记为A2;取蒸馏水1 mL于10 mL具塞刻度试管中，依次分别加入10 mmol·L-1 FeSO4溶液1 mL、10 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液1mL、8.8 mmol·L-1 H2O2溶液1 mL，在37 ℃水浴中反应30 min，在510 nm处测其吸光度值，记为A0。以Vc为阳性对照进行相同实验。取3次平行实验测定的平均值。以样品浓度为自变量，以·OH清除率为因变量做散点图并进行线性拟合，计算IC50值。羟基自由基清除率计算公式如下：

1.4  数据处理

用Microsoft Office Excel 2007软件进行数据整理;用Origin 2018软件绘图;用Minitab 16.0软件对正交试验结果进行统计分析。

2  结果与分析

2.1  单因素试验

2.1.1  提取时间对总黄酮提取效果的影响

由图1可知，在提取时间为1 ～ 6 h内总黄酮含量随着提取时间的增加呈现出先缓慢升高，然后逐渐降低的趋势。当提取时间为4 h时，总黄酮含量达到峰值，9.586 mg·g-1。这可能是因为一定时间范围内黄酮类物质的浸出量随着提取时间的延长而增加;但当提取时间超过4 h后，由于提取时间过长，一方面无用的杂质成分也随着浸出来，另一方面长时间的高温提取会破坏黄酮类物质的稳定性[18]。故确定提取时间为4 h。

2.1.2  料液比对总黄酮提取效果的影响

由图2可知，羊蹄甲果荚总黄酮随着提取溶剂用量的增大呈现出增大的趋势，当提取溶剂体积为原料质量的30倍时，总黄酮含量达到峰值，9.682 mg·g-1。之后总黄酮含量随着提取溶剂用量的增加呈现逐渐下降的趋势。这可能是，当料液比达到1∶30 （g∶mL）时，原料中的黄酮类物质已基本溶出，继续提高提取溶剂用量会增大提取液中其他杂质成分的溶出量，干扰总黄酮含量的测定，所以黄酮含量缓慢下降[19]。此外，溶剂使用量过大会为减压浓缩操作带来不便。故确定料液比为1∶30 （g∶mL）。

2.1.3  提取温度对总黄酮提取效果的影响

由图3可知，随着提取温度在40～90 ℃范围内的升高，羊蹄甲果荚总黄酮含量先缓慢增大再减小，在提取温度为80 ℃时，总黄酮含量达到最大值9.547 mg·g-1。在提取温度高于80 ℃后，总黄酮含量下降。出现这种现象的原因可能是在一定温度范围内，随着提取温度的升高，各种物质的分子运动速度加快，提取溶剂的渗透、扩散速度加快、黄酮类物质溶解速度加快，所以黄酮含量逐渐升高[19]。但回流提取温度过高，会破坏热稳定性差的黄酮类物质的化学结构而且会使其他非黄酮类物质溶出，影响提取效果。故确定提取温度为80 ℃。

2.1.4  乙醇体积分数对总黄酮提取效果的影响

由图4可知，乙醇体积分数在40% ～ 90%范围内，总黄酮含量随乙醇体积分数的增大呈先上升后下降的趋势，乙醇体积分数为70%时总黄酮含量达到峰值，9.715 mg·g-1。这可能是体积分数为70%的乙醇溶液与羊蹄甲果荚总黄酮有较好的亲和能力，促使黄酮类物质最大限度地溶出[20，21]。故确定乙醇体积分数为70%。

2.2  正交试验

由表2可知，影响总黄酮提取效果的因素主次顺序依次为D（乙醇体积分数）>C（提取温度）>A（提取时间）>B（料液比）。通过极差分析结果可知，果荚总黄酮最优回流提取工艺组合为A3B2C2D3，即乙醇体积分数为80%，提取温度为80 ℃，提取时间为5 h，料液比位1∶30 （g∶mL）。因为最佳提取参数组合未出现在正交试验设计表中，因此，需要在该条件下做验证试验，重复5次，测定羊蹄甲果荚总黄酮平均含量为10.837 mg·g-1，大于正交试验结果中的最大含量9.698 mg·g-1，表明该方法准确，重复性好，适于羊蹄甲果荚总黄酮的提取。

由表3可知，A（提取时间）、C（提取温度）、D（乙醇体积分数）3个因素对总黄酮提取效果有极显著影响（P<0.01），B（料液比）对试验结果影响不显著（P>0.05）。

2.3  总黄酮抗氧化性分析

2.3.1  DPPH自由基清除能力评价

依据前述试验方法，将总黄酮和Vc分别配制成一系列浓度梯度的样品溶液并测定各自DPPH·清除率，通过计算不同抗氧化剂的IC50值来评价羊蹄甲果荚总黄酮的抗氧化性。如图5（a）所示，当浓度低于70 μg·mL-1时，总黄酮对DPPH·清除率呈线性关系增加，当浓度大于70 μg·mL-1时，清除率增加趋势变平缓，所以选取总黄酮溶液浓度范围为0 ～ 70 μg·mL-1对其DPPH·清除率进行线性拟合。如图5（b）所示，R2=0.992 3，表明拟合得到的回归方程线性关系良好。如图5（c）和5（d）所示，Vc也有类似结果。

计算出总黄酮IC50值为34.511 μg·mL-1，Vc的IC50值为7.471 μg·mL-1，虽然羊蹄甲果荚总黄酮清除DPPH·能力弱于Vc，但其作为混合物仍然表现出较强的抗氧化性。

2.3.2  羟基自由基清除能力评价

依据前述试验方法，将总黄酮和Vc配制成一系列浓度梯度的样品溶液并测定各自的·OH清除率，通过计算不同抗氧化剂的IC50值来评价总黄酮的抗氧化性。如图6（a）所示，在质量浓度低于0.14 mg·mL-1时，总黄酮对·OH清除率呈线性关系增加，但当质量浓度大于0.14 mg·mL-1时，·OH清除率上升趋势变缓，所以选取质量浓度在0～0.14 mg·mL-1范围内的·OH清除率进行线性拟合。如图6（b）所示，R2=0.991 3，表明拟合后所得回归方程的线性关系良好。如图6（c）和6（d）所示，Vc也有类似结果。

依据上述方法计算出总黄酮IC50值为0.090 mg·mL-1，Vc的IC50值为0.061 mg·mL-1。虽然羊蹄甲果荚总黄酮其清除·OH能力弱于Vc，但其作为混合物仍然表现出较强的抗氧化性。

3  结论

通过单因素试验和正交试验优化得到羊蹄甲果荚总黄酮最佳回流提取工艺条件为提取时间5 h、料液比1∶30 （g∶mL）、提取温度80 ℃、乙醇体积分数80%。在此最优条件下经5次重复验证试验得到羊蹄甲果荚总黄酮平均含量为10.837 mg·g-1。体外抗氧化试验结果表明，羊蹄甲果荚总黄酮对DPPH自由基和羟基自由基具有较强的清除能力，IC50值分别为34.511 μg·mL-1和0.090 mg·mL-1，说明其具有一定的体外抗氧化活性。

参考文献：

[1]石任兵，邱峰. 中药化学[M]. 北京：人民卫生出版社，2016.

[2]张鞍灵，高锦明，王姝清. 黄酮类化合物的分布及开发利用[J].西北林学院学报，2000，15（1）：69-74.

[3]杨之彦，冯志坚，曹忠元. 羊蹄甲属观赏植物的辨别及其园林应用[J]. 广东园林，2011，33（1）：47-51.

[4]吴贻谷，宋立人，胡烈，等. 中华本草：第4卷[M]. 上海：上海科学技术出版社，19996.

[5]Guo H， Bai Z， Xu Y， et al. Anti-inflammation compounds from the seedpods of Pongamiapinnata （L.） Pierre guided by the bioactivity and UPLC-HRESI-MS[J]. Archives of Pharmacal Research，2017，40（7）：818-824..

[6]王桃云，陈鹏，董五科，等. 超声波提取豆荚总黄酮优化工艺与抗氧化性研究[J]. 中国粮油学报，2009，24（6）：114-117.

[7]Muiva L M，Yenesew A，Derese S，et al. Antiplasmodialβ-hydroxydihydrochalcone from seedpods of Tephrosiaelata[J]. Phytochemistry Letters，2009，2（3）：99-102.

[8]董莉莉.刺毛黎豆豆荚中化学成分的提取分离[D].杭州：浙江工商大学，2010.

[9]涂建飞. 菜豆豆荚中化学成分研究[D]. 长春：吉林农业大学，2013.

[10]李治明，张国良，杨雪梅. 脂树果荚的化学成分分析[J]. 广州化工，2016，44（20）：108-110.

[11]曹柏营，戚颖欣，姜秀娟，等. 藤本豆豆荚总黄酮提取及抗氧化活性研究[J]. 食品研究与开发，2016，37（23）：65-69.

[12]Murakami T， Kohno K， Ninomiya K，et al. Medicinal foodstuffs. XXV.Hepatoprotective principle and structures of iononeglucoside， phenethyl glycoside， and flavonololigoglycosides from young seedpods of garden peas，Pisum sativum L.[J]. Chemical Pharmaceutical Bulletin，2001，49（8）：1003-1008.

[13]张玉玺，马红军，何薇，等. 宁夏枸杞菜中总黄酮和芦丁含量的动态变化研究[J]. 当代化工，2014，43（12）：2509-2510.

[14]范金波，蔡茜彤，冯叙桥，等. 咖啡酸体外抗氧化活性的研究[J].中国食品学报，2015，15（3）：65-71.

[15]张光辉，孟庆华，龙旭，等. 响应面法优化超声辅助银杏叶中黄酮的提取及其抗自由基活性研究[J]. 当代化工，2018，47（01）：17-19，25.

[16]Boath A S，Stewart D，Mcdougall G J. Berry components inhibit α-glucosidase in vitro：Synergies between acarbose and polyphenols from black currant and rowanberry[J]. Food Chemistry，2012，135（3）：929-936.

[17]李霄，薛成虎，高立國，等. 芹菜叶中芹菜素的提取工艺优化及其体外抗氧化性研究[J]. 当代化工，2017，46（07）：1293-1298.

[18]徐怀德. 天然产物提取工艺学[M]. 北京：中国轻工业出版社，2018.

[19]刘慧娟，姒海明，张名位，等. 响应面试验优化超声提取八角渣总黄酮工艺研究[J]. 中国调味品，2016，41（10）：12-17.

[20]孙协军，李秀霞，励建荣，等. 乙醇体积分数对山楂提取物黄酮组成及抗氧化活性的影响[J]. 中国食品学报，2017，17（3）：143-150.

[21]黄菊，何伟平. 响应面法优化乙醇提取芹菜中黄酮的工艺研究[J]. 食品研究与开发，2016，37（14）：46-51.