微波辅助提取常春油麻藤花总黄酮工艺及其抗氧化性

杨申明+杨红卫+王振吉++范树国+谢正萍

摘要：为了优化微波辅助提取常春油麻藤花总黄酮的提取工艺，并测定其总黄酮的抗氧化性。采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法测定总黄酮含量，通过正交试验L9（34）优化其总黄酮的提取工艺参数，并就总黄酮对1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O-2[KG-2]· [KG-3]）的清除能力进行初步研究。结果表明：总黄酮最佳提取工艺参数为乙醇体积分数75%，料液比1 g ∶[KG-3]30 mL，微波时间3.5 min，微波功率200 W，在此条件下，总黄酮的平均提取率为19.77%；微波辅助提取的常春油麻藤花总黄酮具有较强的抗氧化性，对DPPH·、羟基自由基和超氧阴离子自由基清除作用明显，且其质量浓度与抗氧化活性呈一定的量效关系。

关键词：常春油麻藤花；微波辅助提取；总黄酮；抗氧化性

中图分类号： R151.3文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0366-04

常春油麻藤（Mucuna sempervirens Hemsl）为蝶形花科（Papilionaceae）常春油麻藤属植物，别称牛马藤、油麻藤子、绵麻藤[1]，在我国主要分布在四川、贵州和云南等地[2]，它是一种药食同源植物，其藤茎、花和种子具有活血、通经活络之功效，常用于风湿疼痛、四肢麻木、血虚贫血、月经不调等病症，具有很好的疗效[1]。常春油麻藤产花量很多，云南楚雄每年2—5月采花炒食、做汤制作蔬菜食用，风味独特，是当地很受欢迎的一道特色野菜。因此，常春油麻藤花在医药和食品工业领域中具有广泛的利用价值。

目前，国内外对常春油麻藤花的研究主要集中在挥发性成分[3]、黄酮类结构鉴定、抗氧化活性成分[4]及抗氧化活性成分提取分离[5]等方面，其他有关常春油麻藤花的研究鲜见报道。近年来，黄酮类化合物越来越多的生物活性被不断发现，其应用范围正逐步扩大，但对常春油麻藤花中总黄酮含量测定及提取工艺的研究未见报道。本研究采用微波辅助提取常春油麻藤花中總黄酮，用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法测定总黄酮含量，通过正交试验L9（34）优化提取工艺。同时，以维生素C为对照，并就所提取的总黄酮对DPPH·、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除作用进行研究，旨在为常春油麻藤花的综合利用提供依据和参考。

1材料与方法

1.1材料与仪器

常春油麻藤花采自云南省楚雄市，经鉴定为蝶形花科常春油麻藤属植物；芸香苷标准品由中国药品生物制品检定所生产，1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）由上海蓝季科技发展有限公司生产，维生素C由昆山谱森实验室用品科技有限公司生产，其他所用化学试剂均为分析纯，由天津市风船化学试剂厂生产。

主要仪器：UV-2100型紫外分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；G80F23CN3P-Q5（QO）型微波炉，广东格兰仕微波炉电器制造有限公司；SE40ZF型电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司；HH-S2型恒温水浴锅，金坛市大地自动仪器厂；SHZ-ⅢA型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；202-00型干燥箱，上海市崇明实验仪器厂。

1.2试验方法

1.2.1标准曲线绘制

采用芸香苷作标准品，用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH[JP3]显色法绘制标准曲线，在502 nm[6]波长处测吸光度，以质量浓度（C）对吸光度（D）进行线性回归，得回归方程 D=7.996 4C+0.002 9，r2=0.999 5。结果表明芸香苷质量浓度在0～0.040 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

1.2.2常春油麻藤花总黄酮提取方法

工艺流程：新鲜常春油麻藤花→洗净风干后置于50 ℃干燥箱烘干→粉碎过40目→用石油醚去除色素和油脂→烘干→得去除色素和油脂的常春油麻藤花干粉（备用）→称量→微波提取→抽滤→定容→测定总黄酮含量。

操作方法：准确称取1.0 g去除色素和油脂的常春油麻藤花干粉，加入乙醇溶液，置于微波中提取，提取完毕后抽滤，滤液定容至50 mL容量瓶中，按标准曲线绘制方法显色，在502 nm波长处测样品溶液吸光度，总黄酮提取率按式（1）计算。

[JZ（]提取率=C×N×V/m×100%。[JZ）][JY]（1）

式中：C表示根据回归方程计算出的黄酮质量浓度，mg/mL；N表示稀释倍数；V表示提取液体积，mL；m表示常春油麻藤花干粉质量，g。

1.2.3单因素试验设计

采用微波辅助进行提取，分别考察以下单因素的影响：（1）乙醇体积分数采用55%、65%、75%、85%、95%的条件下进行比较，料液比1 g ∶[KG-3]40 mL，微波时间3.0 min，微波功率200 W；（2）料液比采用1 g ∶[KG-3]20 mL、1 g ∶[KG-3]30 mL、1 g ∶[KG-3]40 mL、1 g ∶[KG-3]50 mL、1 g ∶[KG-3]60 mL 的条件下进行比较，乙醇体积分数75%，微波时间3.0 min，微波功率200 W；（3）微波时间采用2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 min的条件下进行比较，乙醇体积分数75%，料液比1 g ∶[KG-3]40 mL，微波功率200 W；（4）微波功率采用100、200、300、400、500 W的条件下进行比较，乙醇体积分数75%，料液比1 g ∶[KG-3]40 mL，微波时间3.0 min，从而确定各因素的影响作用。

1.2.4正交试验设计

根据单因素试验结果，选择乙醇体积分数、料液比、微波时间、微波功率进行4因素3水平作 L9（34） 正交试验优化提取条件，因素水平设计，见表1。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

在料液比 1 g ∶[KG-3]40 mL、微波时间3.0 min、微波功率200 W的条件下，探究不同乙醇体积分数55%、65%、75%、85%、95%对常春油麻藤花总黄酮提取率的影响，结果见图1。由图1可知，当乙醇体积分数从55%增大至75%时，总黄酮提取率由12.06%增加至19.21%；当乙醇体积分数从75%增大至95%时，总黄酮提取率由19.21%减小至9.59%。因此，最佳乙醇体积分数在75%附近，选乙醇体积分数65%～85%优化试验。

2.1.2料液比对总黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数75%、微波时间3.0 min、微波功率200 W的条件下，探究不同料液比1 g ∶[KG-3]20 mL、1 g ∶[KG-3]30 mL、1 g ∶[KG-3]40 mL、1 g ∶[KG-3]50 mL、1 g ∶[KG-3]60 mL 对常春油麻藤花总黄酮提取率的影响。由图2可知，当料液比从1 g ∶[KG-3]20 mL增大至1 g ∶[KG-3]40 mL时，总黄酮提取率由13.47%增加至19.24%；[JP3]当料液比从1 g ∶[KG-3]40 mL增大至1 g ∶[KG-3]60 mL时，总黄酮提取率由19.24%减小至1729%。因此，最佳料液比在1 g ∶[KG-3]40 mL附近，选料液比1 g ∶[KG-3]30 mL～1 g ∶[KG-3]50 mL优化试验。

[CM（26]2.1.3微波时间对总黄酮提取率的影响

75%、料液比1 g ∶[KG-3]40 mL、微波功率200 W的条件下，探究不同微波时间2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 min对常春油麻藤花总黄酮提取率的影响。由图3可知，当微波时间从2.0 min延长至3.0 min时，总黄酮提取率由13.66%增加至19.24%；当微波时间从3.0 min延长至4.0 min时，总黄酮提取率由1924%减小至13.36%。因此，最佳微波时间在3.0 min附近，选微波时间2.5～3.5 min优化试验。

2.1.4微波功率对总黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数75%、料液比1 g ∶[KG-3]40 mL、微波时间3.0 min的条件下，探究不同微波功率100、200、300、400、500 W对常春油麻藤花总黄酮提取率的影响。由图4可知，当微波功率从100 W增大至200 W时，总黄酮提取率由17.50%增加至19.20%；当微波功率从200 W增大至500 W时，总黄酮提取率由19.20%减小至12.66%。因此，最佳微波功率在200 W附近，选微波功率100～300 W进行优化试验。

2.2正交试验结果

由表2可知，对常春油麻藤花总黄酮提取率的影响因素由大[CM（25]到小为乙醇体积分数>料液比>微波时间>微波功率。由[CM）]

极差分析得出最佳工艺条件为A2B1C3D2，即乙醇体积分数75%，料液比1 g ∶[KG-3]30 mL，微波时间3.5 min，微波功率200 W。在最佳工艺条件对常春油麻藤花总黄酮进行提取，重复5次，得到总黄酮平均提取率为19.77%（大于正交试验结果中的最高提取率19.62%），相对标准差RSD值为1.32%，表明该方法重现性良好，可用于常春油麻藤花中总黄酮的提取。

2.3常春油麻藤花总黄酮抗氧化性分析

2.3.1清除DPPH·的能力评价

DPPH·是一种以氮为中心的稳定自由基，其乙醇溶液呈紫色，在波长517 nm处有强吸收峰，当有自由基清除剂存在时其溶液颜色变浅，且溶液褪色程度与清除剂的清除能力及数量呈正相关。因此，可根据褪色程度来间接评价其抗氧化剂的抗氧化性[12]。由图5-A 可知，常春油麻藤花总黄酮质量浓度在0.003 9～0.062 8 mg/mL 范围内，随质量浓度增大，清除DPPH·能力增强，当总黄酮质量浓度为0.062 8 mg/mL，清除率最大为82.83%。与同质量浓度维生素C相比，总黄酮清除DPPH·能力稍弱于维生素C（96.33%），但常春油麻藤花總黄酮依然表现出较强的清除DPPH·的能力。

2.3.2清除·OH的能力评价

羟基自由基是活性氧中对生物体危害最大、毒性最强的一种自由基，能与细胞中的分子发生反应，对机体造成损伤，清除羟自由基的能力是评价抗氧化物的重要指标[13-14]。由图5-B可知，常春油麻藤花总黄酮质量浓度在0.003 9～0.062 8 mg/mL范围内，随质量浓度增大，清除羟基自由基能力增强，当总黄酮质量浓度为 0.062 8 mg/mL，清除率最大为85.36%。与同质量浓度维生素C相比，总黄酮清除羟基自由基的能力稍弱于维生素C（9414%），但常春油麻藤花总黄酮也表现出较强的清除羟基自由基的能力。

2.3.3清除O-2[KG-2]· [KG-3]的能力评价

超氧阴离子自由基可通过邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化产生，并生成一种带有颜色的中间产物，该有色中间产物在325 nm波长处有特征吸收峰。当加入O-2[KG-2]· [KG-3]清除剂时，O-2[KG-2]· [KG-3]的生成受到抑制，邻苯三酚自氧化过程受阻，溶液在325 nm处吸收减弱。所以，可通过测定325 nm处吸光度推断清除剂对O-2[KG-2]· [KG-3]的清除率[15-16]。由图5-C可知，常春油麻藤花总黄酮质量浓度在0.0039～0.062 8 mg/mL 范围内，随质量浓度增大，清除超氧阴离子自由基能力增强，当总黄酮质量浓度为0.0628 mg/mL，清除率最大，为70.95%。与同质量浓度维生素C相比，总黄酮清除超氧阴离子自由基的效果与维生素C（72.51%）很接近，表明常春油麻藤花总黄酮具有很强的清除羟基自由基的能力。

3结论与讨论

微波辅助提取常春油麻藤花总黄酮中，影响总黄酮提取效果的因素从强到弱依次为乙醇体积分数>料液比>微波时间>微波功率。经过优化后的提取工艺参数为乙醇体积分数75%，料液比1 g ∶[KG-3]30 mL，微波时间3.5 min，微波功率200 W。在该条件下进行验证性试验，重复5次，得到常春油麻藤花总黄酮平均提取率为19.77%，相对标准差RSD值为1.32%。该提取方法快速省时、操作简单、重复性好，可用于常春油麻藤花中总黄酮的提取和含量测定。

该研究从DPPH·、·OH和O-2[KG-2]· [KG-3]自由基的清除能力3个方面来评价常春油麻藤花中总黄酮抗氧化性。抗氧化性试验结果表明，在常春油麻藤花总黄酮质量浓度0.003 9～0.062 8 mg/mL范围内，随质量浓度的增大，清除DPPH·、·OH和O-2[KG-2]· [KG-3]自由基的能力增强。当总黄酮质量浓度为 0.062 8 mg/mL 时，对DPPH·、·OH和O-2[KG-2]· [KG-3]自由基的清除率最大分别为82.83%、85.36%和70.95%，表明常春油麻藤花总黄酮具有较强的抗氧化能力。因此，常春油麻藤花可作为一种良好的抗氧化物质资源进行开发利用。

本研究结果表明，常春油麻藤花中富含黄酮类物质，该黄酮类物质具有较强的抗氧化性，是一种具有较大开发价值的药食同源植物，相关研究结果对常春油麻藤花中黄酮类物质的提取及抗氧化活性成分的研究具有重要意义。但常春油麻藤花中黄酮类物质发生抗氧化作用的机理目前还不清楚，有待进一步深入研究。

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