铁牛七化学成分的研究

宋 蓓， 王 菲， 李玉泽， 张化为， 黄文丽， 李 翠， 宋小妹*， 刘建利

（1. 陕西中医药大学第二附属医院， 陕西 咸阳712046； 2. 西北大学生命科学院， 陕西 西安710069；3. 陕西省食品药品监督检验研究院， 陕西 西安710065； 4. 陕西中医药大学药学院， 陕西 咸阳712046）

铁牛七又名铁棒锤, 为毛茛科乌头属植物铁棒锤Aconitum szechenyianum Gay. 和伏毛铁棒锤Aconitum flavum Hand. Mazz. 的干燥块根。 其药性味苦、 辛, 性温, 有大毒。 有活血祛瘀、 祛风除湿、止痛消肿等功效。 主治跌打损伤、 风湿、 类风湿关节炎、 牙痛、 腹痛、 毒蛇咬伤等[1]。 二萜类生物碱是铁牛七中主要药效物质基础, 是一类化学结构复杂、 生物活性较强的植物特异性成分[2-6]。 这类成分多具有抗炎、 镇痛、 抗癌、 抗癫痫以及抗寄生虫等作用[7-9]。 目前, 从铁牛七中共分离出22 个二萜生物碱； 伏毛铁棒锤中共分离得到26 个二萜生物碱, 非生物碱6 个, 最近研究表明铁牛七活性成分显示出一定的抗炎和免疫抑制作用[10-11]。 本实验从中分离得到7 个化合物, 其中化合物1 ～4 首次从该植物中分离得到。

1 材料

Bruker-AVANCE400 型核磁共振仪（TMS 为内标, 德国Bruker 公司）； Waters e2695 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； ZF-1 型三用紫外线分析仪（上海金鹏分析仪器有限公司）； 柱层析硅胶（青岛海洋有限公司）； Sephadex LH-20 （美国Ge公司）； LC-6AD 型半制备液相色谱仪（紫外可见光检测器SPD-20A, 日本Shimadzu 公司）； YMCPack-ODS-A 半 制 备 色 谱 柱 （10 mm × 250 mm,5 μm）； 预制硅胶板GF254（青岛海洋化工厂）；OB204 电子分析天平（万分之一, 瑞士Mettler-Toledo 公司）； 超声波清洗器（KQ5200 型, 昆山市超声仪器有限公司）； HH-2 型恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。 色谱纯甲醇（天津科密欧公司）； 娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团）。

药材于2014 年7 月采自甘肃省西山, 经陕西中医药大学生药教研室王继涛高级实验师鉴定为毛茛科乌头属铁棒锤Aconitum szechenyianum Gay. 的块根。

2 提取与分离

铁棒锤干燥根5.0 kg 粉碎后, 用80%乙醇8 倍量加热回流提取3 次, 1.5 h/次, 合并滤液, 减压蒸馏得浸膏。 将浸膏分散于盐酸水溶液（pH 0.8）中, 用石油醚萃取该水溶液, 萃后水相用氨水调至pH 10.26, 再用三氯甲烷萃取碱水相得到总生物碱（50 .0 g）。

取总生物碱47 g, 经硅胶柱层析石油醚-丙酮-二乙胺（50 ∶1 ∶0.1 ～1 ∶1 ∶0.1） 梯度洗脱, 得到7 个部分（Fr.1 ～Fr.7）。 Fr.3 经半制备高效液相（83%甲醇-水） 得到化合物4 （10 mg）。 Fr.6经半制备高效液相（70%甲醇-水） 得到6 个部分（Fr.6-1 ～Fr.6-6）； Fr.6-3 经 半 制 备 高 效 液 相（70%甲醇-水） 得到化合物1 （15 mg）、 2 （10 mg）、 3 （7 mg）； Fr.6-6 经半制备高效液相（65%甲醇-水） 得到化合物7 （23 mg）； Fr.7 经半制备高效液相（65%甲醇-水） 得到化合物5 （7 mg）、6 （30 mg）。

3 结构鉴定

化合物1： 白色无定型粉末, C26H43NO9。 碘化铋钾反应阳性（红棕色）, 表明该化合物可能为生物碱类。1H-NMR （CDCl3, 400 MHz） δ： 3.05（1H, t, J = 6.2 Hz, H-1）, 1.86 （1H, m, H-2）, 2.32 （1H, m, H-2）, 3.76 （1H, dd, J =8.3, 4.6 Hz, H-3）, 2.05 （1H, d, J=6.4 Hz,H-5）, 4.03 （1H, d, J = 5.9 Hz, H-6）, 2.73（1H, brs, H-7）, 2.17 （1H, t, J= 6.3 Hz, H-9）, 1.86 （1H, m, H-10）, 1.96 （1H, m, H-12α）, 2.42 （1H, m, H-12β）, 3.80 （1H, d,J=5.3 Hz, H-14 β）, 4.53 （1H, d, J=5.2 Hz,H-15 β）, 3.14 （1H, J = 6.1 Hz, H-16）, 2.84（1H, brs, H-17）, 3.45 （1H, d, J=8.6 Hz, H-18）, 3.61 （1H, d, J = 8.7 Hz, H-18）, 2.45（ 1H, m, H-19β）, 2.84 （ 1H, m, H-19α）,1.05 （3H, t, J = 7.1 Hz, N-CH2-CH3）, 2.45（1H, m, N-CH2α-CH3）, 2.85 （1H, m, N-CH2β-CH3）, 3.28 （3H, s, C-1-OCH3）, 3.19 （3H,s, C-6-OCH3）, 3.37 （3H, s, C-8-OCH3）, 3.64（3H, s, C-16-OCH3）, 3.30 （ 3H, s, C-18-OCH3）；13C-NMR （CDCl3, 100 MHz） δ： 83.9 （C-1）, 33.5 （C-2）, 71.9 （C-3）, 43.2 （C-4）,46.0 （C-5）, 82.7 （C-6）, 42.5 （C-7）, 83.2（C-8）, 48.2 （C-9）, 41.7 （C-10）, 50.6 （C-11）, 36.9 （C-12）, 76.6 （C-13）, 78.4 （C-14）,77.8 （C-15）, 93.2 （C-16）, 62.5 （C-17）, 77.1（C-18）, 49.0 （ C-19）, 13.5 （ N-CH2-CH3）,47.6 （N-CH2-CH3）, 56.0 （1-OCH3）, 58.8 （6-OCH3）, 50.5 （ 8-OCH3）, 61.1 （ 16-OCH3）,59.3 （18-OCH3）。 以上数据与文献[12] 一致,故鉴定为8-O-methylaconine。

化合物2： 白色无定型粉末（甲醇）, C27H45NO9。碘化铋钾反应阳性（红棕色）, 表明该化合物可能为生物碱类。1H-NMR （CDCl3, 400 MHz） δ： 3.09（1H, t, J = 6.1 Hz, H-1）, 1.97 （1H, m, H-2）, 2.30 （1H, m, H-2）, 3.82 （1H, m, H-3）,2.10 （1H, d, J=6.5 Hz, H-5）, 4.05 （1H, d,J= 5.1 Hz, H-6）, 2.73 （1H, brs, H-7）, 2.22（1H, t, J = 6.9 Hz, H-9）, 1.97 （1H, m, H-10）, 2.04 （1H, m, H-12α）, 2.33 （1H, m, H-12β）, 3.84 （1H, d, J=5.0 Hz, H-14β）, 4.55（1H, d, J=6.1 Hz, H-15β）, 3.15 （1H, J=6.0 Hz, H-16）, 2.87 （1H, brs, H-17）, 3.42 （1H,d, J=8.6 Hz, H-18）, 3.59 （1H, d, J=8.4 Hz,H-18）, 2.48 （1H, m, H-19β）, 2.72 （1H, m,H-19α）, 1.15 （3H, t, J=6.9 Hz, N-CH2-CH3）,2.50 （1H, m, N-CH2α -CH3）, 2.69 （1H, m,N-CH2β -CH3）, 1.09 （3H, t, J = 7.1 Hz, OCH2-CH3）, 2.94 （1H, m, O-CH2α -CH3）, 3.62（1H, m, O-CH2β -CH3）, 3.30 （3H, s, C-1-OCH3）, 3.22 （3H, s, C-6-OCH3）, 3.66 （3H,s, C-16-OCH3）, 3.32 （3H, s, C-18-OCH3）；13CNMR （CDCl3, 100 MHz） δ： 83.4 （C-1）, 33.4（C-2）, 71.7 （C-3）, 43.3 （C-4）, 45.8 （C-5）,82.6 （C-6）, 43.4 （C-7）, 83.9 （C-8）, 49.1（C-9）, 41.6 （C-10）, 50.7 （C-11）, 37.1 （C-12）, 76.7 （C-13）, 78.7 （C-14）, 78.6 （C-15）93.4 （C-16）, 62.5 （C-17）, 77.0 （C-18）, 48.4（C-19 ）, 13.4 （ N-CH2-CH3）, 47.7 （ N-CH2-CH3）, 58.0 （8-O-CH2-CH3）, 16.3 （8-O-CH2-CH3）, 56.0 （1-OCH3）, 59.0 （6-OCH3）, 61.4（16-OCH3）, 59.3 （18-OCH3）。 以上数据与文献[13] 一致, 故鉴定为8-O-ethylaconine。

化合物3： 白色无定型粉末（甲醇）, C33H47NO10。碘化铋钾反应阳性（红棕色）, 表明该化合物可能为生物碱类。1H-NMR （CDCl3, 400 MHz） δ： 3.22（1H, d, J = 6.4 Hz, H-1）, 3.91 （1H, m, H-3）, 2.31 （1H, m, H-5）, 4.09 （1H, d, J=6.7 Hz, H-6β）, 2.78 （1H, brs, H-7）, 2.65 （1H,t, J = 6.1 Hz, H-9）, 2.31 （1H, m, H- 10）,2.13 （ 1H, m, H-12α ）, 2.88 （ 1H, m, H-12β）, 4.81 （1H, d, J=5.1 Hz, H -14β）, 4.54（1H, d, J=5.8 Hz, H-15β）, 3.23 （1H, d, J=5.0 Hz, H-16）, 2.97 （1H, s, H-17）, 3.56（1H, d, J=8.7 Hz, H-18β）, 3.48 （1H, d, J=8.9 Hz, H-18α）, 2.57 （3H, s, N-CH3）, 0.56（3H, t, J = 6.9 Hz, O-CH2-CH3）, 3.20 （1H,m, O-CH2α -CH3）, 3.51 （ 1H, m, O-CH2β-CH3）, 3.30 （3H, s, C-1-OCH3）, 3.26 （3H, s,C-6-OCH3）, 3.74 （3H, s, C-16-OCH3）, 3.31（3H, s, C-18-OCH3）, 8.02 （2H, d, J=7.5 Hz,H-2′, 6′）, 7.54 （1H, t, J = 7.2 Hz, H-4′）,7.43 （2H, t, J = 7.8 Hz, H-3′, 5′）；13C-NMR（CDCl3, 100 MHz） δ： 82.4 （C-1）, 32.9 （C-2）,71.1 （C-3）, 43.8 （C-4）, 45.1 （C-5）, 83.2（C-6）, 44.5 （C-7）, 82.1 （C-8）, 42.6 （C-9）,41.3 （C-10）, 51.0 （C-11）, 36.2 （C-12）, 74.9（C-13）, 79.5 （C-14）, 78.4 （C-15）, 93.3 （C-16）, 62.4 （C-17）, 76.7 （C-18）, 50.5 （C-19）,57.5 （ 8-O-CH2-CH3）, 15.5 （ 8-O-CH2-CH3）,42.8 （ N-CH3）, 56.4 （ 1-OCH3）, 58.9 （ 6-OCH3）, 64.0 （ 16-OCH3）, 59.4 （ 18-OCH3）,166.5 （Ar-CO）, 128.5 （C-1′）, 129.9 （C-2′,6′）, 128.6 （C-3′, 5′）, 133.2 （C-4′）。 以上数据与文献 [14] 一致, 故鉴定为8-O-ethyl-14-benzoylmesaconine。

化合物4： 白色无定型粉末（甲醇）, C32H45NO10。碘化铋钾反应阳性（红棕色）, 表明该化合物可能为生物碱类。1H-NMR （CDCl3, 400 MHz） δ： 3.12（1H, d, J = 5.6 Hz, H-1）, 4.20 （1H, m, H-3）, 2.24 （1H, m, H-5）, 4.20 （1H, d, J=5.5 Hz, H-6）, 2.86 （1H, s, H-7）, 2.54 （1H, t,J=6.3 Hz, H-9）, 2.14 （1H, m, H-10）, 4.92（1H, d, J=5.1 Hz, H-14β）, 4.75 （1H, d, J=5.6 Hz, H-15β）, 3.28 （1H, m, H-16）, 2.88（1H, brs, H-17）, 3.45 （1H, d, J=8.3 Hz, H-18β）, 3.56 （1H, d, J= 8.3 Hz, H-18α）, 1.32（3H, t, J=7.3 Hz, N-CH2-CH3）, 3.31 （3H, s,C-1-OCH3）, 3.24 （ 3H, s, C-6-OCH3）, 3.70（3H, s, C-16-OCH3）, 3.35 （ 3H, s, C-18-OCH3）, 8.02 （2H, d, J = 7.2 Hz, H-2′, 6′）,7.51 （1H, t, J=7.4 Hz, H-4′）, 7.43 （2H, t,J = 7.8 Hz, H-3′, 5′）；13C-NMR （CDCl3, 100 MHz） δ： 81.3 （C-1）, 29.9 （C-2）, 70.1 （C-3）, 42.6 （C-4）, 43.9 （C-5）, 81.5 （C-6）,43.5 （C-7）, 80.3 （C-8）, 43.8 （C-9）, 40.8（C-10）, 50.2 （C-11）, 35.6 （C-12）, 74.5 （C-13）, 78.5 （C-14）, 79.0 （C-15）, 90.4 （C-16）,64.6 （C-17）, 77.4 （C-18）, 50.2 （C-19）, 11.7（ N-CH2-CH3）, 48.2 （ N-CH2-CH3）, 55.5 （1-OCH3）, 58.6 （ 6-OCH3）, 61.1 （ 16-OCH3）,59.4 （18-OCH3）, 166.6 （Ar-CO）, 130.1 （C-1′）, 130.2 （ C-2′, 6′）, 128.7 （ C-3′, 5′）,133.2 （C-4′）。 以上数据与文献[15] 一致, 故鉴定为苯甲酰乌头原碱。

化合物5： 白色无定形粉末。 C32H45NO10。 碘化铋钾反应阳性（红棕色）, 表明该化合物可能为生物碱类。1H-NMR （CDCl3, 400 MHz） δ： 2.99（3H, d, J=4.9 Hz）, δ 6.22 （1H, s, N-H）； δ 7.75 （2H, d, J = 7.1 Hz, H-2′/H-6′）, 7.45（1H, t, J=7.3 Hz, H-4′）, 7.40 （2H, t, J=7.7 Hz, H-3′/H-5′）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3） δ：27.0 （N-CH3）, δ 168.5 （-C=O）, δ 127.0 （C-3′,5′）, 128.8 （ C-2′, 6′）, 131.6 （ C-1′）, 134.9（C-4′）。 以上数据与文献[16] 一致, 故鉴定为N-甲基苯甲酰胺。

化合物6： 白色针状结晶（CH3OH）, 易溶于乙醚、 三氯甲烷、 难溶于水, Liebermann-Burchard反应呈阳性。 通过与β-谷甾醇对照品共TLC, 经3种不同溶剂系统（石油醚-乙酸乙酯、 石油醚-丙酮、 二氯甲烷-丙酮） 展开, 其Rf值均一致, 故鉴定为β-谷甾醇。

化合物7： 白色粉末, 通过与棕榈酸对照品共TLC, 经3 种不同溶剂系统展开, 其Rf值均一致,且混合熔点不下降, 故鉴定为棕榈酸。

4 讨论

前期研究表明铁牛七中富含生物碱。 本研究从铁牛七中共分离得到5 个生物碱, 再次证明了铁牛七中主要化学成分为生物碱。 Hiroshi 等[17-18]研究表明, 苯甲酰乌头原碱减少醋酸所致小鼠扭体次数, 具有一定的镇痛作用, 而在高剂量时对急性渗出性炎症有较强的抑制作用, 为研究新的抗炎镇痛中药新剂型提供依据。 Jin-jun Wu[19]研究了苯甲酰乌头原碱对于多药耐药相关蛋白2 （MRP2） 和乳腺癌抗药性蛋白（BCRP） 的作用, 结果表明其显著增加了MRP2 和BCRP 的表达, 确定了其药动学行为, 对乌头属植物的安全临床应用具有重要意义。 而关于这5 个生物碱的活性及其作用机制研究仍然较少, 因此有待进一步研究。