冬虫夏草内生菌皮壳青霉菌化学成分的研究

冯 丹， 秦玲玲， 郑东滨， 赵鑫雅， 曹雪凤， 冉 向， 戴 宇， 邓 赟

（成都中医药大学药学院， 中药材标准化教育部重点实验室， 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地， 成都611137 中国）

皮壳青霉菌Penicillium crustosum 为半知菌亚门半知菌纲壳霉目杯霉科青霉属真菌。 目前, 采用不同的培养条件, 从其代谢产物发现了吲哚类、 二酮哌嗪类、 喹啉类、 苯二氮卓类生物碱、 聚酮类、 没食子酸等, 具有抗增殖、 抗炎、 神经毒性等作用[1-3]。 冬虫夏草是我国传统的名贵中药材, 具有免疫调节、 抗菌、 抗肿瘤、 抗氧化、 抗衰老、 降血糖血脂等药理作用, 且仅生长在青藏高原高寒地区[4]。 其内生菌与冬虫夏草的长期的生存过程中可能产生与宿主相同或相似的代谢和防御机制, 进而更易产生结构新颖、 活性广泛的代谢产物。 之前在对其内生菌的代谢产物的研究中发现了许多结构新颖具有显著生物活性的化合物[5]。 课题组也从冬虫夏草内生菌中分离得到了多个化合物, 从中发现了新颖结构[6-8]。 从冬虫夏草中成功分离到一株内生菌P. crustosum, 对其大米固体发酵产物进行研究。 本实验从中分离得到13 个化合物, 其中化合物1～7、 9～13 为首次从该菌中分离得到。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Finnigan-LCQDECA 质谱仪（美国赛默飞世尔公司）； Bruker Ascend 400 核磁共振仪（德国布鲁克公司）； 中压层析柱[利穗科技（苏州）有限公司]； NP7000 型制备型高效液相色谱仪（江苏汉邦仪器有限公司）； 柱层析硅胶（300 ～400 目）、 薄层层析硅胶板（青岛海洋化工厂）；Pack ODS-A HPLC 柱（日本YMC 株式会社）。

1.2 菌种来源 于新鲜冬虫夏草中分离得到一株内生真菌（编号DCXC-20160503-XHX-20160908-2-1-1）。 将其进行测序, 根据形态特征和18S rRNA基因序列比对, 鉴定该菌株为 Penicillium crustosum。 该菌种现保存于成都中医药大学药学院生化制药实验室。

1.3 培养基

1.3.1 活化培养基 葡萄糖20 g/L、 土豆（去皮） 200 g/L、 琼脂18 g/L。

1.3.2 种子培养基 葡萄糖20 g/L、 可溶性淀粉8 g/L、 蛋 白 胨5 g/L、 酵 母 膏2 g/L、 氯 化 钠2 g/L、 碳酸钙2 g/L、 硫酸镁0.5 g/L、 磷酸氢二钾0.5 g/L。

1.3.3 大米固体培养基 大米40 g/瓶, 蛋白胨2 g/瓶, 自来水40 mL/瓶。

2 提取与分离

将活化后的P. crustosum 菌株接种于种子培养基中, 于28 ℃、 200 r/min 条件下培养2 d 得到种子液, 再将种子液转接到灭菌后的300 瓶装有大米固体培养基的发酵瓶中, 室温下静置培养40 d。 发酵完毕, 将发酵产物用甲醇超声提取3 次后, 合并后浓缩得到浸膏, 再用乙酸乙酯萃取3 次, 合并萃取液, 回收溶剂得到浸膏224.1 g。

将乙酸乙酯部位浸膏经硅胶柱层析分离, 以石油醚-丙酮梯度洗脱, 分析合并, 得到组份A（20.0 g）、 B （5.5 g）、 C （0.9 g）、 D （29.4 g）、E （22.6 g）、 F （43.5 g）、 G （8.7 g）、 H （2.1 g）。 组份C 经Sephadex LH-20 柱层析, 由三氯甲烷-甲醇 （1 ∶1） 洗脱, 分析合并得到组份C1（75.8 mg）、 C2 （109.6 mg）、 C3 （403.6 mg）、C4 （148.3 mg）、 C5 （50.0 mg）。 组份C2 经半制备HPLC 分离得化合物1 （28.4 mg）。 组份C3 经半制备HPLC 分离得化合物2 （2.5 mg）、 3 （1.4 mg）、 4 （1.2 mg）。 组份C4 经半制备HPLC 分离得化合物5 （2.5 mg）、 6 （1.4 mg）。 组份C5 经半制备HPLC 分离得化合物7 （5.6 mg）、 8 （4.5 mg）、 9 （1.3 mg）。 组份D 经MCI 柱层析, 由甲醇-水（3 ∶7 ～10 ∶0） 洗脱, 分析得到25 个亚组份D1～D25, 组份D6 经半制备HPLC 分离得到化合物10 （1.3 mg）。 组份D8 经半制备HPLC 分离得化合物11 （7.0 mg）。 组份D9 经半制备HPLC分离得化合物12 （1.14 mg）。 组份D10 经半制备HPLC 分离得化合物13 （9.0 mg）。

3 结构鉴定

化合物1： 黄色粉末； ESI-MS m/z： 317 [M+Na]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 12.81 （1H,s, 5-OH）, 7.31 （1H, s, H-7）, 5.93 （1H, s, 2-OH）, 4.81 ～4.70 （1H, m, H-10）, 2.75 ～2.69（1H, m, H-4b）, 2.51 （3H, s, H-14）, 2.46 （1H,dd, J=16.6, 11.9 Hz, H-4a）, 2.14 （3H, s, H-15）, 2.02 （1H, dd, J= 14.3, 10.8 Hz, H-9b）,1.80 （1H, td, J=14.1, 3.8 Hz, H-3）, 1.31 （3H,d, J= 6.2 Hz, H-11）, 1.15 ～1.13 （3H, m, H-12）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3） δ： 202.9 （C-13）, 160.4 （C-5）, 157.3 （C-8a）, 129.5 （C-7）,117.3 （C-8）, 112.7 （C-6）, 110.6 （C-4a）, 100.5（C-2）, 65.4 （C-10）, 44.2 （C-9）, 34.9 （C-3）,26.2 （C-14）, 25.0 （C-11）,23.7 （C-4）,15.8 （C-12, 15）。 以上数据与文献[9] 基本一致, 故鉴定为6-乙酰基-2α, 5-二羟基-2- （2-羟丙基） -3α,8-二甲基苯并二氢吡喃。

化合物2： 黄色油状物； ESI-MS m/z： 113[M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 5.82（1H, d, J=1.3 Hz, H-6）, 4.38 （2H, t, J=6.3 Hz, H-3）, 2.37 （2H, t, J=6.2 Hz, H-4）, 2.00（3H, s, H-7）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3） δ：164.8 （C-1）, 157.8 （C-5）, 117.0 （C-6）, 66.0（C-3）,29.4 （C-4）,23.1 （C-7）。 以上数据与文献[10] 基本一致, 故鉴定为4-甲基-5, 6-二氢吡喃酮。

化合物3： 白色粉末； ESI-MS m/z： 161 [M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 8.34 ～8.31（1H, m, H-6）, 8.06 （1H, s, H-2）, 7.79 ～7.69（2H, m, H-8,9）,7.51 （1H, t, J=7.4 Hz, H-7）,3.60 （3H, s, 3-CH3）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3）δ： 161.8 （C-4）, 148.5 （C-10）, 147.0 （C-2）,134.3 （C-8）, 127.6 （C-6, 9）, 126.5 （C-7）,122.2 （C-5）, 34.2 （3-CH3）。 以上数据与文献[11] 基本一致, 故鉴定为3-甲基-4-喹唑啉酮。

化合物4： 黄色油状物； ESI-MS m/z： 167 [M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 7.14 （2H,d, J=8.4 Hz, H-2, 6）, 6.78 （2H, d, J=8.4 Hz,H-3, 5）, 3.69 （3H, s, -OCH3）, 3.55 （2H, s, H-7）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3） δ： 172.7 （C-8）,154.9 （C-4）, 130.6 （C-1）, 126.2 （C-2, 6）,115.7 （C-3, 5）, 52.2 （-OCH3）, 40.4 （C-7）。 以上数据与文献[12] 基本一致, 故鉴定为4-甲氧基苯乙酸。

化合物5： 黄色油状物； ESI-MS m/z： 155[M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 3.82,3.85 （6H, s, -OCH3×2）, 6.34 （1H, dd, J=8.6,2.8 Hz, H-5）, 6.47 （1H, d, J= 2.7 Hz, H-3）,6.73 （1H, d, J = 8.6 Hz, H-6）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3） δ： 150.2 （C-4）, 150.1 （C-2）,143.6 （C-1）, 112.6 （C-6）, 105.9 （C-5）, 100.8（C-3）, 56.7 （4-OCH3）, 56.0 （2-OCH3）。 以上数据与文献[13] 基本一致, 故鉴定为2, 4-二甲氧基苯酚。

化合物6： 浅黄色粉末； ESI-MS m/z： 167[M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 3.56（2H, s, H-7）, 3.70 （3H, s, -OCH3）, 6.74 （2H,d, J=8.0 Hz, H-3, 5）, 7.10 （2H, d, J=7.8 Hz,H-2, 6）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3） δ： 173.51（C-8）, 155.2 （C-4）, 130.5 （C-2, 6）, 125.5 （C-1）, 115.7 （C-3, 5）, 52.3 （-OCH3）, 40.4 （C-7）。以上数据与文献[7] 基本一致, 故鉴定为对羟基苯基乙酸甲酯。

化合物7： 无色针晶（甲醇）, mp 116～118 ℃；ESI-MS m/z： 123 [M+H]+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ： 9.80 （1H, s, H-7）, 7.83 ～7.77 （2H,m, H-2, 6）, 6.97 ～6.93 （2H, m, H-3, 5）；13CNMR （100 MHz, CD3OD） δ： 192.4 （-CHO）,163.8.0 （C-4）, 133.2 （C-2, 6）, 129.9 （C-1）,117.0 （C-3, 5）。 以上数据与文献[14] 基本一致, 故鉴定为对羟基苯甲醛。

化合物8： 无色粉末； ESI-MS m/z： 167 [M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CD3OD） δ：7.58 （1H, s,H-6）, 6.28 （1H, s, H-3）, 2.54 （3H, s, H-8）,2.16 （3H, s, H-9）；13C-NMR （100 MHz, CD3OD）δ： 204.1 （C-7）, 164.5 （C-4）, 164.7 （C-2）,134.1 （C-6）, 118.2 （C-1）, 114.0 （C-5）, 102.8（C-3）,26.2 （C-8）,15.8 （C-9）。 以上数据与文献[9] 基本一致, 故鉴定为2, 5-二羟基-4-甲基苯乙酮。

化合物9： 无色粉末； ESI-MS m/z： 167 [M+H]+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.62 （1H,d,J=8.9 Hz, H-6）, 6.43 （1H, d, J=8.8 Hz, H-5）,2.57 （3H, s, H-8）, 2.08 （3H, s, H-9）；13C-NMR（100 MHz, CD3OD） δ： 204.3 （C-7）, 164.3 （C-4）, 164.1 （C-2）, 131.1 （C-6）, 113.9 （C-3）,112.2 （C-1）, 108.1 （C-5）, 26.1 （C-8）, 7.5 （C-9）。 以上数据与文献[15] 基本一致, 故鉴定为2, 4-二羟基-3-甲基苯乙酮。

化合物10： 无色油状物； ESI-MS m/z： 183[M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CD3OD） δ： 6.70（2H, m, H-2, 5）, 6.56 （1H, d, J=7.8 Hz, H-6）, 3.66 （3H, s, -OCH3）, 3.46 （2H, s, H-7）；13C-NMR （100 MHz, CD3OD） δ： 174.5 （C-8）,146.3 （C-3）, 145.5 （C-4）, 127.0 （C-1）, 121.6（C-6）, 117.4 （C-2）, 116.3 （C-5）, 52.4 （-OCH3）, 41.2 （C-7）。 以上数据与文献[16] 基本一致, 故鉴定为3, 4-二羟基苯乙酸甲酯。

化合物11： 白色粉末； ESI-MS m/z： 233 [M+Na]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ：5.75 （1H, s,N-H）, 4.15～4.09 （1H, m, H-6）, 4.02 （1H, dd,J=9.5, 3.5 Hz, H-9）,3.64～3.51 （2H, m, H-3）,2.40～2.31 （1H, m, H-5）, 2.19 ～1.98 （3H, m,H-4, 5, 10） 1.96 ～1.84 （1H, m, H-4）, 1.77 ～1.67 （1H, m, H-11）, 1.52 （1H, ddd, J=21.2,10.6, 5.8 Hz,H-10）,1.01 （3H,d,J=6.5 Hz,H-13）, 0.96 （3H, d, J = 6.5 Hz, H-12）；13C-NMR（100 MHz, CDCl3） δ： 170.2 （C-1）, 166.2 （C-7）,59.2 （C-6）, 53.5 （C-9）, 45.7 （C-3）, 38.8 （C-10）, 29.8 （C-5）,25.0 （C-11）,23.5 （C-4）,22.9（C-12）, 21.3 （C-13）。 以上数据与文献[17] 基本一致, 故鉴定为环（脯氨酸-亮氨酸）。

化合物12： 无色油状物； ESI-MS m/z： 183[M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 6.83（1H, d, J=7.9 Hz, H-5）, 6.77 （2H, d, J=8.9 Hz, H-2, 6）, 3.88, 3.86 （6H, s, 3-OCH3, 4-OCH3）, 3.84 （2H, d, J = 6.4 Hz, H-8）, 2.82（2H, t, J = 6.5 Hz, H-7）；13C-NMR （100 MHz,CDCl3） δ： 149.3 （C-3）, 147.9 （C-4）, 131.1 （C-1）, 121.1 （C-6）, 112.5 （C-2）, 111.7 （C-5）,63.9 （C-8）, 56.1, 56.0 （-OCH3）, 38.9 （C-7）。以上数据与文献[18] 基本一致, 故鉴定为3, 4-二甲氧基苯乙醇。

化合物13： 无色小针晶（氯仿）, mp 172.3 ～172.9 ℃； ESI-MS m/z： 205 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz, CDCl3） δ：7.78 （1H, d, J=8.2 Hz, H-6）, 7.60 （1H, s, H-2）, 6.92 （1H, d, J=8.3 Hz,H-5）, 3.95, 3.94 （each, 3H, s, -OCH3）；13C-NMR（100 MHz, CDCl3） δ： 172.0 （-COOH）, 153.9 （C-4）, 148.9 （C-3）, 124.8 （C-6）, 121.9 （C-1）,112.5 （C-2）, 110.5 （C-5）, 56.2, 56.1 （-OCH3）。以上数据与文献[19] 基本一致, 故鉴定为3, 4-二甲氧基-苯甲酸。

4 讨论

本实验从冬虫夏草内生菌P. crustosum 的大米固体发酵物中分离得13 个化合物, 主要为聚酮类和生物碱, 其中化合物1 ～7、 9 ～13 为首次从该菌种中分离得到。 此次得到化合物与文献报道的情况有所差异, 原因可能为菌种来源和培养条件不同影响内生菌基因的表达, 进而影响其代谢产物的产生。 因此在内生菌代谢产物的研究中, 可以通过改变培养基以及表观遗传修饰等手段进行代谢产物的优化。