超声波辅助优化香菇多糖的提取工艺

（黄河科技学院医学院，河南郑州450063）

香菇（Lentinus edodes），又名花菇、香蕈，是世界第二大食用菌，也是我国的特产之一。香菇味道鲜美、营养丰富，为药食两用的佳品。研究发现香菇多糖是香菇中生物活性成分，具有抗感染[1]、抗肿瘤[2]、降血糖[3]和提高免疫力[4]等多方面功效，从上世纪80年代开始，香菇多糖作为生物反应调节剂而用于临床，可以激活细胞免疫功能、产生肿瘤坏死因子，能与化疗药物合用，显著提高抗肿瘤的效果[5-7]。近年来，香菇多糖的提取技术也日益成熟，超声波辅助提取方法已被广泛应用到植物有效成分的提取中，该技术能利用超声波的空化作用，使香菇细胞及细胞膜构造发生改变，而不改变多糖结构，有效成分能更快的溶入溶剂[8]，具有提高香菇多糖提取率、缩短提取时间、操作方便的优点[9-10]。本研究以香菇为研究对象，采用超声波辅助方法提取香菇中多糖，设计单因素试验进行分析，以料液比、超声功率、温度、超声时间为考察因素，通过正交试验优化香菇多糖提取工艺，在此条件下得到最佳提取工艺条件，并使用苯酚-浓硫酸方法测定香菇多糖得率，具有提取率高、节省时间、能耗低等优点，为香菇多糖进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

香菇：郑州市世纪联华超市，将干香菇于烘箱中干燥，室温密封保存。

1.1.2 试剂

葡萄糖（GR）：上海阿拉丁试剂网；苯酚：洛阳昊华化学试剂有限公司；浓H2SO4：洛阳市化学试剂厂；无水乙醇：天津市科密欧化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯；5%苯酚溶液：黄河科技学院药物分析实验室自制。

1.1.3 仪器

KQ-500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；3号药典筛（孔径0.36 mm，50目）、5号药典筛（孔径0.18 mm，80目）：浙江上虞市五四仪器筛具厂；远红外鼓风干燥箱：天津市华北实验仪器有限公司；SHZ-D（Ш）循环水式多用真空泵：邦西仪器科技（上海）有限公司；FA1004型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；TU-1810紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；XFB-200型粉碎机：吉首市中诚制药机械厂。

1.2 试验方法

1.2.1 香菇的预处理

将干香菇除去杂质，于50℃烘箱中干燥至恒重，经XFB-200型粉碎机粉碎得香菇粉末，将粉末先后过3号和5号药典筛、装瓶，于室温下密封保存。

1.2.2 超声波辅助提取香菇多糖工艺流程

香菇→干燥→粉碎→超声→抽滤→浓缩→加蒸馏水定容→加入5%苯酚溶液→加浓H2SO4→摇匀放置→冷却→于紫外可见分光光度计中490 nm波长下测定吸光度值（A）。

1.2.3 葡萄糖标准曲线的绘制

准确称量1.000 0 g干燥至恒重的葡萄糖标准品，于100 mL容量瓶中加水定容，得到10 mg/mL葡萄糖储备液。精密移取1.0 mL储备液于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别精密移取葡萄糖标准溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于50 mL容量瓶中，加蒸馏水至2.0 mL，加入1.0 mL5%苯酚溶液与5.0 mL浓硫酸，摇匀，避光静置15 min，于紫外-可见分光光度计490 nm处测定吸光度值A[11-12]，并以葡萄糖标准溶液浓度C（mg/mL）为横坐标x，吸光度值A为纵坐标y，绘制标准曲线，如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

由图1得线性回归方程为：y=0.910 7x-0.184 7，R2=0.999 1，在标准溶液浓度0.2 mg/mL～1.2 mg/mL范围内，显示出良好的线性关系。

1.2.4 样品香菇多糖含量的测定

香菇多糖得率的计算公式为：

香菇多糖得率/%=（C×V×N/m）×100[13-14]

式中：C为由标准曲线得到的香菇多糖的质量浓度，mg/mL；V为定容后的总体积，mL；N为溶液最终的稀释倍数；m为香菇粉质量，g。

1.3 单因素试验设计

分别选取料液比、超声功率、温度、超声时间为单因素，分别按照超声波辅助提取香菇多糖工艺流程进行多糖提取的单因素试验[15]。

1.4 正交试验设计

为了获得香菇多糖的最优提取工艺，根据单因素试验得出的结果，根据料液比、超声功率、温度、超声时间4个主要因素，设计四因素三水平的正交试验，确定香菇多糖的最优提取工艺条件。

1.5 数据分析和处理

标准曲线的绘制与单因素试验中数据分析处理均采用OriginPro8.0软件，每次均设置3个平行试验，求平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 最佳料液比的确定

固定超声时间20min，超声功率300W，温度60℃。准确称取1.00 g香菇粉末于5个锥形瓶中，分别设置料液比为 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），分别加入蒸馏水 10、20、30、40、50 mL，置于数控超声波清洗器中，设置超声时间20 min，冷却至室温，抽滤，保留滤液。置于蒸发皿中浓缩，浓缩液转移至100 mL容量瓶，定容。用移液管各移取2.0 mL于5个100 mL容量瓶中加蒸馏水定容，之后各移取4.0 mL溶液于50 mL容量瓶中，分别加入5%苯酚溶液2.0mL、浓硫酸10.0mL，摇匀，静置冷却至室温。空白溶液为4.0 mL蒸馏水、2.0 mL 5%苯酚溶液与10.0 mL浓硫酸的混合溶液。于紫外-可见分光光度计490 nm处测吸光度值A，代入葡萄糖标准曲线公式得出浓度，进而计算多糖得率。该项目进行平行试验3次，求其平均值，RSD=2.77%。料液比对香菇中多糖得率的影响见图2。

图2 料液比对香菇中多糖得率的影响Fig.2 Effect of solid-liqiud rate on the extraction yield of polysaccharides from lentinan

由图 2 可知，料液比在 1∶10（g/mL）～1∶50 之间（g/mL），随着料液比的增加，香菇多糖的得率也在增加，料液比在1∶50（g/mL）时香菇多糖得率最高，但在料液比为1∶40（g/mL）时多糖得率增加幅度大于在1∶50（g/mL）时的多糖得率增幅。这说明在一定浓度范围内，增加溶剂的量对香菇多糖的提取有利，当香菇多糖的溶出达到平衡后再增加溶剂量对多糖的提取率影响不大，另外，考虑到能耗[16]，将最佳料液比确定为 1 ∶40（g/mL）。

2.1.2 最佳超声功率的确定

固定超声时间 20 min，料液比 1 ∶40（g/mL），温度60℃。准确称取香菇粉末1.00 g于5个锥形瓶中，依次各加蒸馏水40 mL。置于数控超声波清洗器中超声20 min，抽滤，保留滤液。置于蒸发皿中浓缩，浓缩液转移至100 mL容量瓶，定容。用移液管各移取2.0 mL于5个100 mL容量瓶中加蒸馏水定容，之后各移取4.0mL溶液于50 mL具塞比色管中，分别加入5%苯酚溶液2.0 mL、浓硫酸10.0 mL，摇匀，静置冷却至室温。空白溶液为4.0 mL蒸馏水、2.0 mL 5%苯酚溶液与10.0 mL浓硫酸的混合溶液。于紫外-可见分光光度计490 nm处测吸光度值A，代入葡萄糖标准曲线公式得出浓度，进而计算多糖得率。该项目进行平行试验3次，求其平均值，RSD=2.71%。超声功率对香菇中多糖得率的影响见图3。

图3 超声功率对香菇中多糖得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides from lentinan

由图3可知，香菇多糖得率随着超声功率的增加先升高后降低，在超声功率为200 W的时候多糖得率达到最高值10.52%，当超声功率继续增加时，多糖得率出现下降的趋势。这可能是由于超声波功率较低时，对香菇细胞壁破壁程度逐渐增加，使香菇中多糖溶出增多而使提取率升高，而超声功率超过200 W时，由于功率的持续增大，超声波的破碎效应和热效应使香菇中的杂质溶出也逐渐增多，多糖成分和杂质可能会发生反应，导致多糖的提取率相应下降。因此，将最佳超声功率确定为200 W。

2.1.3 最佳超声温度的确定

固定超声时间20 min，功率 200 W，料液比1∶40（g/mL）。准确称取1.00 g香菇粉末于5个锥形瓶中，依次各加40 mL蒸馏水。温度分别为40、50、60、70、80℃，置于数控超声波清洗器中超声20 min，冷却至室温，抽滤，保留滤液。置于蒸发皿中浓缩，浓缩液转移至100 mL容量瓶，定容。用移液管各移取2.0 mL于5个100 mL容量瓶中定容。之后各移取4.0 mL溶液于50 mL具塞比色管中，分别加入5%苯酚溶液2.0 mL、浓硫酸10.0 mL，摇匀，静置冷却至室温。空白溶液为4.0 mL蒸馏水、2.0 mL 5%苯酚溶液与10.0 mL浓硫酸的混合溶液。于紫外-可见分光光度计490 nm处测吸光度值A，代入葡萄糖标准曲线公式得出浓度，进而计算多糖得率。该项目进行平行试验3次，求其平均值，RSD=2.64%。超声温度对香菇中多糖得率的影响见图4。

图4 超声温度对香菇中多糖得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polysaccharides from lentinan

由图4可知，随着超声温度的升高，香菇多糖得率先升高后降低，在超声温度为50℃时香菇多糖得率最高，这可能是由于超声温度50℃时，能加快溶剂分子的扩散速度，也促进多糖的溶出，多糖得率较高。温度超过50℃以后，多糖得率出现下降的趋势，尤其在50℃～60℃时，多糖得率急剧下降，则可能是由于多糖发生降解的缘故，之后多糖得率又出现上升的趋势，是由于温度的持续升高，使得多糖的氧化加重。因此，将最佳超声温度确定为50℃。

2.1.4 最佳超声时间的确定

固定超声温度50℃，功率 200 W，料液比1∶40（g/mL）。各取1.00 g香菇粉于5个锥形瓶中，各加40 mL蒸馏水，置于数控超声波清洗器中，超声温度为50 ℃。时间分别为 10、20、30、40、50 min。之后冷却至室温，抽滤，保留滤液。置于蒸发皿中浓缩，浓缩液转移至100 mL容量瓶，定容。用移液管各移取2.0 mL于5个100 mL容量瓶中定容。之后各移取4.0 mL溶液于50 mL具塞比色管中，分别加入5%苯酚溶液2.0 mL、浓硫酸10.0mL，摇匀，静置冷却至室温。空白溶液为4.0 mL蒸馏水、2.0 mL 5%苯酚溶液与10.0 mL浓硫酸的混合溶液。于紫外-可见分光光度计490nm处测吸光度值A，代入葡萄糖标准曲线公式得出浓度，进而计算多糖得率。该项目进行平行试验3次，求其平均值，RSD=2.56%。超声时间对香菇中多糖得率的影响见图5。

图5 超声时间对香菇中多糖得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharides from lentinan

由图5可知，随着超声时间的延长，多糖成分会逐渐的溶出，在超声时间为40 min时香菇多糖得率最高，之后又出现降低的趋势，这说明超声时间过长时，多糖的结构可能会遭到破坏，杂质的溶出量也会增加，导致香菇多糖的提取率下降。因此，将最佳超声时间确定为40 min。

2.2 正交试验结果

选择料液比（A）、超声功率（B）、温度（C）、超声时间（D）作为正交试验的4个因素，每个因素设计考察3个水平，研究其对香菇中多糖得率的影响，设计L9（34）正交试验因素水平表，试验中香菇多糖因素水平选取见表1，试验设计结果如表2所示：

表1 香菇多糖正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal experiment factors and levels table of polysaccharides from lentinan

表2 香菇多糖正交试验结果表Table 2 Orthogonal experiment results and analysis table of polysaccharides from lentinan

由表1和表2中香菇多糖正交试验结果可知，影响多糖提取率的各因素主次关系为：A＞D＞C＞B，最优工艺参数是A3B3C2D2，香菇多糖得率最高的条件为料液比 1∶50（g/mL），超声功率 300 W，温度 50℃，超声时间40 min。

2.3 验证性试验

为进一步验证正交试验结果，固定料液比1∶50（g/mL）、超声功率300 W、温度50℃、超声时间40 min。精密称取1.00 g香菇粉末在香菇多糖提取正交试验中最优提取工艺条件下进行试验，平行操作3份，见表3。

表3 验证性试验结果Table 3 Verification testing results

如表3所示，得到的多糖得率求其平均值为11.73%，RSD=3.02%，显示该超声波辅助提取香菇多糖的工艺条件准确可靠，结果重现性较好。

3 结论

研究以香菇多糖得率为指标，采用超声波辅助优化的方法提取香菇中多糖，通过单因素水平试验分别探索料液比、超声功率、温度、超声时间4个因素对香菇多糖得率的影响。在此基础上设计L9（34）正交试验因素水平表，分别筛选了上述4个因素中对香菇中多糖的提取率影响较显著的3个水平，用四因素三水平正交试验设计进行香菇多糖提取工艺的优化。试验结果显示，采用超声波辅助提取香菇多糖的最佳工艺参数为：料液比1∶50（g/mL），超声功率 300W，温度50℃，超声时间40 min。结果表明：在此工艺条件下香菇多糖得率最高，并且料液比是超声波辅助提取过程中的关键因素。在最优工艺条件下进行3次平行试验，香菇多糖平均得率为11.73%。说明该工艺条件稳定可行，具有一定的实用价值。

香菇味道绝佳、营养价值高，香菇多糖药效明显，使得香菇在药品和保健食品等领域有着很好的应用前景。香菇多糖的提取研究能够使香菇资源得到有效利用，为香菇多糖的深入研究开发提供参考。