细叶韭花提取物抗氧化及抑制亚硝化反应的研究

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

人体在新陈代谢中会产生大量的活性氧，包括羟自由基、超氧阴离子自由基等[1]，这些自由基的存在会对机体组织有一定损害甚至导致疾病，如脂质过氧化、动脉粥样硬化、心血管疾病等[2-3]。亚硝胺是一种极强的致癌物质，人群中流行病学调查表明，人类某些癌症，如胃癌、食道癌、肝癌、结肠癌和膀胱癌等的形成可能与亚硝胺有关[4]。国内外学者通过体外细胞实验证实了很多蔬菜水果的提取液均有清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成的作用，从而保护细胞免受N-亚硝胺的毒害[2]。许多试验结果也证实天然植物中的活性成分如黄酮[5]、多酚[6]对抗氧化、清除亚硝酸盐、阻断亚硝胺合成都有一定的贡献。从天然植物中寻求低毒、安全的抗氧化剂以及抑制亚硝化作用的活性成分越来越受广大学者的关注。

细叶韭（Allium tenuissimum）为百合科葱属多年生草本植物[7]，又叫摘麻花、麻麻花、野韭花，主要分布于中国的东北、河北、内蒙古、山西晋北等地区[8]，其顶端花序可食用。细叶韭花具有独特的风味，没有葱蒜那种刺激性味道，常作为一种蔬菜、腌制品、调味品食用，有的还对其进行了香精油提取以作为面食佐料[9]。此外，细叶韭花还具有降血糖、降血脂、软化血管、防止肿瘤、补肾、解毒等功效[10-11]。

目前对细叶韭花的研究主要集中在其生物特性[12]、栽培保存[13]、物候观测[14]及化学成分[15-17]等方面。关于细叶韭花抗氧化活性的研究，国内外尚未见报道。本试验以细叶韭花为研究对象，采用不同溶剂对细叶韭花进行提取，测定了各提取物的总酚、总黄酮、总糖、还原糖含量以及抗氧化和抑制亚硝化反应效果，以期为细叶韭花作为天然抗氧化剂提供科学理论依据，为细叶韭花的开发利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

细叶韭花：购买自山西省朔州市朔城区山老汉农产品开发有限公司。干燥后用组织捣碎机捣碎，过80目筛，置于干燥器保存待用。

没食子酸：天津市光复精细研究所；芦丁：中国食品药品检定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）：美国Sigma公司；福林酚：北京索莱宝科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、水杨酸等其他试剂均为分析纯。

BS124S电子分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；JYL-012九阳多功能榨汁机：九阳股份有限公司；HH-2恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；80目国家标准筛：华天筛网金属制品有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHB-IIIA循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；UV-Probe 2550双光束紫外光谱仪：日本岛津公司。

1.2 方法

分别称取经干燥、过筛处理的细叶韭花5.00 g于250 mL锥形瓶中，按照1∶10（g/mL）的比例分别向其中加入水、95%乙醇、乙酸乙酯、石油醚提取2次，减压抽滤，浓缩至浸膏，得水提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物，置于-4℃冰箱中保存备用。总酚含量测定采用福林酚比色法[18-19]；总黄酮含量采用硝酸铝比色法[20]；总糖含量采用苯酚-硫酸法[21]；还原糖含量采用水杨酸法[22]。抗氧化活性通过测定DPPH自由基清除能力[23-24]、ABTS+自由基清除能力[25-26]、总还原力[27]来评价；体外模拟胃液条件，采用盐酸萘乙二胺法[28-29]测定亚硝酸盐清除能力、采用α-萘胺法[30-35]测定亚硝胺合成阻断能力。所有抗氧化试验均采用VC作为阳性对照。

1.3 数据处理

每个试验数据均平行测定3次，结果以x±SD表示。采用origin 8.5软件作图并用SPSS 18.0数据处理软件进行单因素方差分析和相关性分析，P＜0.05在统计学上具有显著性差异，P＜0.01在统计学上具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 总酚、总黄酮、总糖、还原糖含量

不同溶剂提取物中总酚、总黄酮、总糖、还原糖含量如表1所示。

表1 不同溶剂提取物中总酚、总黄酮、总糖、还原糖的含量Table 1 The total phenolics content，total flavonoids content，total sugar content，reducing sugar content of different solvents extracts from Allium tenuissimum flowers mg/g

由表1可知，各提取物均可有效地提取出细叶韭花中的活性成分，但提取程度有所不同，其中水提取物中总糖和还原糖含量高于其他3种提取物，分别为（50.32±1.23）、（30.33±0.05）mg/g；95%乙醇提取物中总酚和总黄酮含量高于其他3种提取物，分别为（11.80±1.09）、（12.65±0.85）mg/g。

2.2 体外抗氧化试验

2.2.1 DPPH自由基清除能力

细叶韭花不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除能力见图1。

由图1可知，细叶韭花各提取物浓度在0.05mg/mL～1 mg/mL范围内，对DPPH自由基的清除能力随着提取物质量浓度的增加而增大。各提取物对DPPH自由基清除能力的IC50值见表2。

图1 细叶韭花不同溶剂提取物对DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging rate of different solvents extracts from Allium tenuissimum flowers

表2 不同溶剂提取物抗氧化活性的IC50值Table 2 IC50values of antioxidant activity from different solvents extracts

由表2可知，在测试浓度范围内，石油醚提取物对DPPH自由基的清除率未达到50%，水提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物对DPPH自由基清除能力的 IC50值分别为（0.53±0.01）、（0.57±0.02）、（0.62±0.08）mg/mL，且各提取物对DPPH自由基清除能力的差异性均达到显著水平（P＜0.05），其中水提取物清除DPPH自由基的效果最佳。但对DPPH自由基清除能力均弱于VC。

2.2.2 ABTS+自由基清除能力

细叶韭花不同溶剂提取物对ABTS+自由基清除能力见图2。

由图2可以看出，各提取物对ABTS+自由基均有良好的清除能力，且与浓度呈正相关关系。由表2可知，在测试浓度范围内，石油醚提取物的ABTS+自由基清除率未达到50%，水提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物清除能力的IC50值分别为（0.60±0.04）、（0.84±0.01）、（1.09±0.02）mg/mL。对 ABTS+自由基清除能力的顺序依次为：水提取物＞95%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞石油醚提取物，清除能力均弱于阳性对照VC对ABTS+自由基的清除能力。

图2 细叶韭花不同溶剂提取物对ABTS+自由基清除能力Fig.2 ABTS+radical scavenging rate of different solvents extracts from Allium tenuissimum flowers

2.2.3 还原能力

细叶韭花不同溶剂提取物的总还原力见图3。

图3 细叶韭花不同溶剂提取物的总还原力Fig.3 Total reducing capacity of different solvents extracts from Allium tenuissimum flowers

相同条件下，试验测定了不同溶剂提取物对应的还原力，结果用OD值表示，OD值越大，还原力越大。由图3可知，不同溶剂提取物的还原力随着样品质量浓度的增加而增大。其中水提取物的还原力最大，其次是95%乙醇提取物，石油醚提取物的还原力最小。当浓度为5 mg/mL时，水提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物的OD值分别为0.77、0.70、0.68、0.56。

2.3 细叶韭花提取物抑制亚硝化作用试验

2.3.1 清除亚硝酸盐能力

在模拟胃液条件下，细叶韭花各提取物对亚硝酸盐的清除作用结果及IC50值如图4、表3所示。由图4可知，细叶韭花各提取物对亚硝酸盐均有一定的清除作用，且具有剂量依赖性，对亚硝酸盐清除能力顺序由高到低为：水提取物[IC50=（2.00±0.02）mg/mL]＞95%乙醇提取物 [IC50=（3.50±0.12）mg/mL]＞乙酸乙酯提取物 [IC50=（4.00±0.08）mg/mL]＞石油醚取物 [IC50=（6.26±0.06）mg/mL]，各提取物对亚硝酸盐的清除能力均弱于阳性对照 VC[IC50=（0.41±0.08）mg/mL]。

2.3.2 阻断亚硝胺合成的能力试验

在体外模拟胃液条件下，细叶韭花各提取物对亚硝胺合成的阻断作用结果及IC50值如图5及表4所示。

图4 细叶韭花不同溶剂提取物对亚硝酸盐清除作用的影响Fig.4 Effect of concentration on nitrite-scavenging capacity of various solvents extracts from Allium tenuissimum flowers

表3 细叶韭花不同溶剂提取物和VC抑制亚硝化作用的IC50值Table 3 IC50values of inhibitory effect on nitrosation different solvents extracts from Allium tenuissimum flowers and VC

图5 细叶韭花不同溶剂提取物对亚硝胺合成抑制能力的影响Fig.5 Effect on inhibitory N-nitrosamines formation capacity of different solvent extracts from Allium tenuissimum flowers

由图5可知，细叶韭花各提取物均能阻断亚硝胺的合成，且在测试浓度范围内，亚硝胺合成阻断率随着提取物质量浓度的增加而增大，其中水提取物[IC50=（3.00±0.01）mg/mL]的阻断能力最强，当质量浓度为10 mg/mL时，其阻断率可达90.27%，远大于其他提取物，但弱于阳性对照 VC[IC50=（2.41±0.11）mg/mL]。

2.4 相关性分析

为进一步考察细叶韭花提取物中各活性成分与其抗氧化活性之间的关系，对不同溶剂提取物总酚含量、总黄酮含量、总糖含量、还原糖含量及其抗氧化活性间进行相关性分析，其相关系数R2如表4所示。

表4 不同提取物各成分含量及其抗氧化能力的相关性分析Table 4 Correlation analysis between compounds contents and antioxidant activity of different solvents extracts

总酚含量与DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力之间呈极显著相关（R2＞0.80，P＜0.01），与总还原力之间呈显著相关（0.50＜R2＜0.80，P＜0.05），但与亚硝酸盐清除能力及阻断亚硝胺合成能力的相关性不显著（P＞0.50）；总黄酮与DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力之间呈极显著相关（R2＞0.80，P＜0.01）；总糖与ABTS+自由基清除能力、总还原力、亚硝酸清除能力、亚硝胺合成阻断能力之间均呈极显著相关（R2＞0.80，P＜0.01）；还原糖与 ABTS+自由基清除能力、亚硝酸盐清除能力、亚硝胺合成阻断能力之间呈极显著相关（R2＞0.80，P＜0.01），与 DPPH 自由基清除能力、总还原力之间呈显著相关（0.50＜R2＜0.80，P＜0.05）。

3 讨论

本试验对细叶韭花不同溶剂提取物中活性成分、体外抗氧化活性、清除亚硝酸盐、阻断亚硝胺合成进行了研究。结果表明细叶韭花中具有多种活性成分，并且能够有效地清除DPPH和ABTS+自由基，还能在模拟胃液条件下清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺的合成，对延缓衰老、预防癌症等方面具有重要意义。

正常情况下，机体中活性氧的产生及清除或中和处于动态平衡。当机体处于疾病、有害环境时，活性氧大量产生，机体不能够及时将其清除，进而导致组织和细胞损伤[36-37]。Boora等[2]认为多酚类化合物的抗氧化机制是中和脂质自由基，防止过氧化氢分解为自由基。由本文细叶韭花提取物中各活性成分与抗氧化活性之间相关性分析可知，抗氧化活性与多酚和黄酮具有一定的相关性，这与Zhou等[38]所得结论一致。亚硝酸盐和硝酸盐常被添加到肉制品中用于护色、防腐、延长货架期，但在体内适宜的胃液环境中，易与胺类化合物反应，产生有毒的N-亚硝胺，具有较强的致癌作用，能引起人和动物胃、肝脏等多种脏器的恶性肿瘤。Zhan等[5]认为黄酮类化合物、多酚类化合物可有效地清除亚硝酸盐；郑晶泉[37]认为多糖可以直接捕获脂质过氧化过程中产生的活性氧，减缓或抑制脂质过氧化反应的进行；李利华[39]的试验表明多糖具有较强的抗氧化能力及亚硝酸盐清除能力。本研究首次对细叶韭花提取物清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成进行测定，且水提取物清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成的效果最佳，由提取物中活性成分含量和亚硝酸清除能力、亚硝胺合成阻断能力的相关性分析可知，这是水提物中的总糖、还原糖、总酚和总黄酮共同作用的结果。这一结果将为细叶韭花的开发利用提供一定的科学理论依据。