影响种公猪精液保存效果的因素分析

陈 辉

（华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，农业农村部猪遗传育种重点开放实验室，湖北 武汉 430070）

猪的人工授精（AI）技术是一种优良的种猪繁育技术，AI 可以改善种猪的繁育利用率、促进猪群遗传改良的进展以及不同场间的基因交流。该技术为全世界大多数集约化养猪生产企业所采用，随着我国规模化养猪进程的加快，AI 技术在我国养猪生产中发挥了巨大的作用[1]。随着养猪规模进一步扩大，养殖生产厂家对优质公猪精液的需求量日益增加，AI 技术使用的效果在很大程度上取决于公猪精液品质的好坏，因而改善优秀种公猪精液保存的效果对AI 技术的广泛推广应用具有积极意义。文章从影响种公猪精液保存效果的因素作了较为系统的阐述，从抗冻剂[2]、抗氧化剂[3]、抗菌肽[4]、稀释液配方及方法[5]等方面阐述了对种公猪精液保存效果的影响，并简要地分析了种公猪精液品质的评价体系。笔者结合国内外的相关研究，就影响种公猪精液保存效果的因素分析加以综述，阐明各因素对种公猪精液保存效果的影响，旨在为种猪繁育研究人员、公猪站以及种猪生产企业一线人员提供思路和科学依据，促进场间的遗传交流，进一步改善我国整体养猪生产水平以及地方畜禽资源的保种情况，打造出中国种猪种业航母。

1 种公猪精液品质保存效果的评价指标

在现代规模化养猪生产中，种公猪精液品质对养猪生产的效益具有很大影响。我国猪精液品质评价标准（GB/T 25172-2010）要求检测公猪精液的外观（要求颜色呈乳白色，无杂质）、精子密度（要求高于1 亿/mL）精子活力（要求高于0.6）、每剂量直线前进的精子数（要求高于25 亿）、精液pH（精液呈弱碱性，要求pH 在7.0 ～7.8 之间）、顶体完整率（要求高于51%为合格）以及畸形率（要求低于20%）等指标来衡量精液保存的效果[6]。除此以外，部分企业和种公猪站也会对精子的活动能力、精液中相关酶（抗氧化性酶）、冷休克指标以及微生物等指标进行测定，从而对精液品质进行全面评定，但目前这些企业要求尚无具体标准。

2 影响种公猪精液保存效果的因素

2.1 抗冻剂

冷冻保存法是长期保存种猪精液的有效措施，猪精液对低温敏感，在冷冻过程会使猪精液发生“冷休克”现象，从而降低其使用价值，因而大量的学者针对这一现象开发了多种抗冻剂。Fang 等[2]在大白猪精液缓冲液中添加了40%的异源精浆（SP），观察其对冻融精液品质的影响，与对照组比（未添加SP），SP 组精液的活力和精子穿透力显著增加（P ＜0.05），降低了精子低温获能和酪氨酸磷酸化（P ＜0.05），同时观察到AI 母猪的妊娠率显著增加了42.64%（P＜0.05）。Trzcinska 等[7]发现在杂交猪（波兰长白×大白猪）精液冷冻保存液中添加1.0 mM 丁基化羟基甲苯（BHT）可以改善猪精液冷冻保存效果，该研究观察到使用添加BHT 的冷冻精液进行AI 可以显著降低精液的脂质过氧化（P ＜0.001），显著增加精子的运动能力、膜完整性以及顶体完整性（P＜0.001），表明添加1.0 mMBHT有利于精液冷冻保存以及提高精子的受精能力。有研究发现，在精液冷冻保存液中添加鸵鸟蛋黄（LPFO）可提高冻融后精子的活力，提高有效精子数[8]。有研究表明，在猪精液冷冻培养液中添加2 mM 还原型谷胱甘肽（GSH）以探索其对精液冷冻保存和冻融精子品质的影响，结果表明，使用添加GSH 后的精液显著提高了分娩率、总产仔数以及产活仔数（P ＜0.05），表明GSH 对冷冻保存精液的品质具有很好的改善作用[9]。Athurupana 等[10]研究了海藻糖替代部分甘油对精液冷冻保存效果的影响，使用100 mM 海藻糖替代冷冻剂甘油，结果发现对解冻后精子的活力无显著变化，但替代后显著改善了解冻精子的活动性、显著增加了线粒体膜电位（MMP），表明用海藻糖替代部分甘油是可行的，对精液冷冻保存效果具有改善作用。

2.2 抗氧化剂

精子在冷冻保存过程中容易被氧化，导致受精能力降低乃至丧失，因而开发一种抗氧化剂对精液冷冻保存效果的改善具有重要意义，大量研究表明黄芪多糖（APS）、芹菜素（AP）和阿魏酸（FA）对精液冷冻保存的抗氧化效果具有改善作用。Weng 等[11]评估了黄芪多糖（APS）对低温保存精子抗氧化性的影响，在保存液中添加了0.5 mg/mL APS，解冻后37 ℃孵育1 h 后，APS 组与对照组（未添加抗氧化剂）相比，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性显著增加、活性氧（ROS）浓度显著降低（P ＜0.05），同时APS 组精液的受精率得到了改善、卵裂率和胚泡率显著增加（P ＜0.05），表明APS 可通过改善冷冻精液的抗氧化性来改善精液的繁殖能力。芹菜素（AP）和阿魏酸（FA）是一种良好的抗氧化剂，对冷冻保存精液具有很好的改善作用，已有研究证实，在冷冻保存液中添加0.1 mmol / L AP 加0.15 mmol / L FA可增加冻融精液抗氧化酶活性，改善了冻融精液的运动性、质膜完整性、顶体完整性以及线粒体活性[12]，表明两者联合使用具有很好的改善作用。研究证实，在冷冻稀释液中添加0.2 g/L 芝麻酚能显著提高解冻后猪精子活率（P ＜0.05）、改善功能完整性和抗氧化能力（P ＜0.05）[13]。

常温保存（17 ℃条件下储存）也是精液液体保存的一种主要方法，为防止液体精液在保存期间发生氧化应激，Wang 等[14]首次在精液BTS 保存液中添加了不同剂量（0、10、20、40 和80 mM）的L-谷氨酰胺（L-Glu），以探索L-Glu 对常温保存精液抗氧化性的影响，结果表明，添加L-Glu 后会显著降低活性氧浓度（ROS）、同时显著增强了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）活性和精子中谷胱甘肽（GSH）的含量；此外研究还发现添加20 mM Gln 时对精子的运动性、顶体完整性以及质膜完整性具有显著的改善作用（P ＜0.05）。胡亚美等[15]研究结果表明，在BTS 精液稀释液中添加50 μg/mL 原花青素（OPC）可改善藏猪精液的抗氧化性能、精子活率以及顶体完整率（P ＜0.05）。相似的研究发现，常温精液稀释液中添加0.5 μmol/L 的抗氧化剂虾青素对17 ℃下保存精液的活力和运动性得到改善，研究认为虾青素对猪精液常温保存具有改善作用[16]。综上表明，稀释液中添加适宜的抗氧化剂对精液的冷冻保存或常温保存效果具有改善作用。

2.3 抗菌肽

精液在保存过程中容易滋生细菌微生物，从而对精液的保存效果产生不利影响。抗菌肽（AMP）是一种氨基酸多肽，具有广谱杀菌活性和低耐药性，被开发应用于精液保存过程中。相关研究发现，在稀释液中添加抗菌肽（AMP）有助于抵御微生物侵袭，进而改善精液保存效果。Puig-Timonet 等[4]评估了猪β 防御素-1（PBD1）和猪β 防御素-2（PBD2）是否有替代抗生素的可能，在17 ℃保存精液的稀释液中，保存10 d 后使用琼脂评估了3 种不同浓度AMP 对微生物的抑制作用，结果发现当AMP 的添加量为3 μM时具有显著的抑菌作用，但不会对精子活力产生显著影响，研究表明PBD-1 和PBD-2 可替代抗生素添加到保存液中。Sancho 等[17]在17 ℃保存的稀释液中添加了（2.5，25 和100 μg/ mL）的微生物肽（PG1），以评估其抑菌能力，平板试验表明细菌数随PG1 浓度增加而显著降低（P ＜0.05），但精子存活率与PG1的浓度增加而显著降低（P ＜0.05），因而需要合理选择AMP 的浓度方能平衡抑菌和保持精液品质。而据Bussalleu 等[18]报道，稀释液中添加3 μM 猪骨髓抗菌肽37（PMAP-37）可以有效地抑制细菌生长，同时可以很好地保存精子活力，研究认为PMAP-37 是一种潜在抗生素替代物。除此以外，也有研究报道，阳离子微生物肽也是潜在的抗生素替代物，研究发现添加低浓度环状六肽（4 μMc-WFW，2 μMc-WWW）时的精子各项指标与对照组无显著差异，同时发现可以有效地促进精子进行直线运动[19]。综上说明抗菌肽在精液保存中起着重要作用，在生产中应合理选择抗菌肽种类和浓度。

2.4 稀释配方及稀释方法

大量研究表明不同的稀释液以及稀释方法会对种公猪精液保存的效果产生很大的影响。在不同稀释液对精液保存效果的影响方面，Dziekonska 等[20]研究了3 种不同商业稀释液（BTS、Androhep（AH）、Gedil（GD））对精子预冷和冻融后的影响，结果表明，AH 稀释液组精子质膜完整性和ATP 含量显著高于BTS 和GD 组（P ＜0.05），且谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性显著高于BTS 稀释液，综合来看，使用AH 稀释液有助于解冻后精子品质的改善。贾玉川等[21]研究结果表明，使用美国某精液稀释液后的精子活力好、活力高以及存活时间长，表明其保存效果优于日本、西班牙以及国产精液稀释液。谭晓山等[22]研究发现自行研制稀释液配方4 适用于杜洛克猪，而配方2 适用于大白猪（具体配方请见参考文献）。

不同的稀释方法对精液保存的效果也会产生影响，Schulze 等[23]比较了一步等温稀释、两步稀释以及三步稀释法对精液品质的影响，发现一步法稀释后的精子的耐热性显著高于两步法和三步法（P ＜0.05），同时一步法省时省力，降低了稀释错误，研究认为在实际生产中选择一步稀释法为好。有研究指出，不同的稀释顺序（对照：将稀释剂加入至精液中；反向：将精液加入稀释液中）会对精子分布产生显著影响（P ＝0.029）[24]。何经纬等[25]发现使用精确稀释法生产的常温精液瓶数显著高于使用传统稀释法生产的常温精液量（P ＜0.05）。综上表明，不同的稀释液以及稀释方法对精液保存效果具有很大影响，在实际生产中，应根据实际情况合理选择稀释配方及稀释方法。

2.5 其他因素

除了上述因素对会对精液保存效果产生影响外，保存液的pH、季节以及温度等因素均会对精液保存效果产生影响。研究表明，保持冷冻稀释液的pH 为8（弱碱性）的条件下能够有效改善解冻后精子的质量[26]。也有研究发现，温合保存液的pH 有利于精液的常温保存[27]。Fraser 等[28]研究表明秋冬季节时公猪的精子完整性、顶体完整率以及渗透压耐受性显著高于春夏季节（P ＜0.05），表明季节因素也是影响精液保存的一个重要因素。在温度因素方面，有研究发现36 h 17 ℃和25 ℃下活精子数显著高于8 ℃下保存的精子数（P ＜0.05）；在超低温冷冻后猪猪精子活力、质膜完整率、线粒体活性和顶体完整率显著低于新鲜精液（P ＜0.05）[29-30]。

3 小结与展望

纵观全文，影响猪精液保存的因素主要有抗冻剂、抗氧化剂、抗菌肽、稀释配方以及稀释方法等因素。除此以外，pH、季节以及温度也是重要的影响因素；在实际生产中，通过在保存液添加抗冻剂、抗氧化剂以及抗菌肽，同时选择合理的稀释配方和稀释方法，可以有效地改善精液保存效果，从而使精液在AI 中发挥更大的作用。但是还有诸多因素会影响猪精液的保存效果，如pH 对精液保存效果的相关研究鲜有报道、不同抗冻剂、抗氧化剂等相互配伍的相关研究较少，今后可加大相关研究的力度；同时精液相关评定标准还尚需完善（如可全面测定精子抗氧化性指标、冷休克指标等）。相信随着分子生物技术的发展以及国家AI 技术的大力推广和使用，相关研究将会得到开展、标准将会更加完善，有效地解决上述问题，从而进一步改善猪精液保存的效果，发挥AI 技术的优势，使优良公猪的繁殖性能得到更好的发挥，强化场间的遗传交流，从整体生产上改善我国的生猪养殖水平。