副溶血性弧菌耐药基因的研究进展

郑 林祝令伟郭学军∗陈 萍

（1．吉林农业大学食品与工程学院，长春130118；2．军事医学研究院军事兽医研究所／吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春130122）

自从1921年发现青霉素具有抗菌活性后［1］，从医药、农牧业到水产业，人们对于抗生素的使用日渐增加。抗生素的大量使用挽救了无数生命，也促进了农牧业产品的生产，但同时也造成了细菌耐药性的广泛流行。细菌获得耐药基因之后，还可通过转化、转导和接合等方式将耐药基因传递到其他细菌中，甚至可以在不同种属的细菌中传播，使受体细菌获得更多的耐药性，从而增加了治疗的难度。水环境是发生耐药基因水平传递的最佳场所，副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水环境中的主要病原菌，于1950年在日本首次被发现［2］。该菌的O3K6 血清型曾引起1994年印度加尔各答和1998年美国两次大规模食物中毒事件，最后通过使用抗生素控制了疫情［3-4］。据美国疾病控制和预防中心（CDC）报道，自2001年以来副溶血性弧菌感染的发生率又开始显著提升［5］。在美国，平均每年有215 人感染副溶血性弧菌，其中有30 人住院，1～2 人死亡［6］。用于治疗副溶血性弧菌感染的推荐抗生素为四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮类和磺胺类［7］，其中四环素或环丙沙星还可用于副溶血性弧菌的长期治疗［6］。大部分副溶血性弧菌对抗生素都比较敏感，但是，近几年副溶血性弧菌对抗生素的抗性也逐年增加。本文就近几年副溶血性弧菌对抗生素的耐药现状进行对比分析，并对其耐药机制和耐药基因的水平转移的研究进展进行综述。

1 副溶血性弧菌耐药性的现状

1．1 美洲 通过对2005年到2014年美国的水环境、路易斯安那海湾的零售牡蛎和墨西哥加利福尼亚州的海龟样品进行副溶血性弧菌分离和耐药数据对比发现，副溶血性弧菌对氨苄西林具有严重的抗性。对比2005年在水环境分离的菌株与零售牡蛎中分离的菌株的耐药数据，零售牡蛎中分离得到具有氨苄西林抗性的菌株分离率为57%，略高于水环境中分离得到的氨苄西林抗性菌株，但是在零售牡蛎中未分离出具有多重耐药的菌株；在墨西哥海龟中分离的菌株与美国水环境中分离的菌株的耐药率并无太大差别，都仅表现出对氨苄西林的抗性，对于其他的抗生素仅表现出较低的抗性。到目前为止，在美洲分离的副溶血性弧菌对于青霉素类药物具有严重的抗性，对于其他类型的抗生素自2012年以后都得到了很好的控制［8-11］。

1．2 欧洲 分析2001年到2013年分别对亚得里亚海鱼场、贝类、临床样品、新鲜及冷冻的海产品和英国的林肯郡的贝类中分离得到的副溶血性弧菌耐药数据、并与美洲的耐药数据对比，二者相同的是大部分副溶血性弧菌都表现出严重的氨苄西林抗性，但在英国的林肯郡的贝类中分离得到的副溶血性弧菌的氨苄西林耐药率仅为1．3%，这与美洲和意大利中分离的具有氨苄西林抗性的菌株的结果出入较大。欧洲分离的副溶血性弧菌的耐药率整体而言比美洲的要高，直到2013年，副溶血性弧菌的耐药得到了一定的控制，但是仍然对一些弧菌属推荐的抗生素（如氨苄西林、阿莫西林、四环素、甲氧苄啶-磺胺甲基异恶唑）具有一定的耐药性［12-14］。

1．3 亚洲 2002年到2016年对我国东南沿海地区（包括上海市、深圳市、江苏省、浙江省等地）中分离的77 株O3K6 血清型副溶血性弧菌进行耐药鉴定，其中对氨苄西林、磺胺甲基异恶唑和链霉素的耐药率最高，分别为84．42%、36．36%、32．47%，多重耐药率高达14．29%。在韩国分离的副溶血性弧菌的多重耐药率显著高于中国，44 株中就有25 株为多重耐药菌株，并且在2003年到2016年期间，韩国的副溶血性弧菌的耐药率呈明显的上升趋势，多重耐药率从2015年的56．8%上升到2016年的93．3%。在马拉西亚的调查发现，副溶血性弧菌的耐药情况也相当的严重，2014年的时候几乎所有的副溶血性弧菌都对氨苄西林、青霉素、甲氧西林和新生霉素耐药，到了第二年，氨苄西林的耐药率有所下降，但是头孢类及四环素的抗性却增加，这些头孢类及四环素抗性的菌株多来自于贝类［15-19］。

1．4 非洲 2012年和2016年对南非和尼日利亚中分离得到的副溶血性弧菌进行药敏实验发现，2016年在尼日利亚分离得到的菌株的耐药率远高于2012年在南非分离得到的菌株的耐药率，其中2016年的分离的菌株的多重耐药率高达67．6%，而2012年分离的菌株则仅表现出对青霉素、甲氧苄啶-磺胺甲基异恶唑和头孢噻吩具有较强的抗性［20-21］。

2 副溶血性弧菌的耐药机制

细菌对于外界不良环境（如危害其生存的抗生素）有很强的适应性。从进化的角度来看，细菌可采用多种方式来应对抗生素的杀伤作用。主要包括与药物作用机制相关的基因突变、激活外排机制来排出药物、产生水解抗生素的酶类［22］以及通过水平基因转移（HGT）获得编码外源耐药基因［22］等。

2．1 副溶血性弧菌靶位基因的改变 细菌通过基因突变产生耐药性的机制主要是通过对抗生素作用靶位的改变来降低对药物的亲和力，从而导致药物效果减低；也有通过突变减少细胞壁上的受体从而导致减少药物的摄取达到耐药。例如，喹诺酮类药物的作用靶位是DNA 促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ，它通过干扰DNA 的复制和转录功能以达到杀菌作用［23］。弧菌属细菌可以通过gyrA突变和parC突变达到抵抗作用。gyrA基因的第83 位氨基酸ser突变为lle 或parC基因的第85 位氨基酸ser 突变为phe 均可导致副溶血性弧菌获得喹诺酮抗性［24-26］；副溶血性弧菌编码外膜蛋白（OMP）的vpa0116 基因也同样与喹诺酮抗性有关，具有vpa0116 基因的副溶血性弧菌在Na+浓度增加时会对庆大霉素的耐药性有所提高［27］。在肺炎克雷伯中发现，qnrA基因与喹诺酮的多重耐药有关，Saga T 等在副溶血性弧菌中发现VPA0095 基因与qnrA基因互为同源染色体，具有该基因的副溶血性弧菌同样可以对喹诺酮类药物产生抗性［28］。

2．2 副溶血性弧菌的外排膜泵 细菌对抗生素的外排系统包括四类：主要协助蛋白转运超家族（MFS）、小多耐药蛋白超家族（SMR）、耐药结节分化超家族（RND）、ATP 结合盒超家族（ABC）［29］。副溶血性弧菌中的RND 家族与副溶血性弧菌的外膜蛋白VPoC 协同作用可产生耐药性［30］。在副溶血性弧菌中发现一个新的外排膜泵家族MATE 家族，其中的保守区域为Asp32，Glu261 和Asp367，这些氨基酸残基在某种程度上参与了转运过程［31］。MATE 家族中的NorM基因与大肠杆菌中的YdhE基因具有高度的同源性［29］。

2．3 副溶血性弧菌产生水解酶类 β-内酰胺类药物可以通过破坏细菌细胞壁合成达到杀灭细菌的作用，该药物具有毒性低作用范围广等特点。细菌抵抗β-内酰胺类药物的主要机制之一是产生水解β-内酰胺的β-内酰胺水解酶［32］。弧菌属细菌均存在VbrK／VbrR基因，该基因调控blaA 所编码的β-内酰胺酶与β-内酰胺类抗生素的抗性有关［33］。副溶血性弧菌对头孢菌素产生抗性比较少见，β-内酰胺酶中的blaPER-1基因、blaCMY-2基因和blaTEM基因与第三代和第四代头孢菌素的抗性有关。副溶血性弧菌中的A 类羧苄青霉素水解β-内酰胺酶家族（CARB）blaCARB-17可产生对青霉素的固有耐药，blaCARB-17家族中的blaV110基因同样介导副溶血性弧菌的氨苄西林、哌拉西林和青霉素耐药，该基因与假单胞菌属中的PSE-4 基因具有高度同源性［34］。

2．4 副溶血性弧菌的耐药基因水平传递 细菌主要以三种方式获得外源遗传物质，分别为转化、转导和接合，在细菌内部可通过整合子将多种耐药基因重组成为多重耐药菌，而整合子还可以以移动的基因盒的形式将新基因重组到细菌染色体或质粒等遗传物质中［22，35］。

2．4．1 转化 转化是指受体菌细胞从环境中吸收裸露的外源DNA，从而获得外源DNA 所携带的遗传信息。在自然环境中只有那些处于感受态的细胞才能获得外源DNA，该水平转移方式在自然界中比较少见［22］。但是，最近有研究表明副溶血性弧菌的胞外DNA 可以通过特殊的生物膜而进行传递形成群体耐药［36-38］。

2．4．2 转导 转导是指噬菌体通过尾轴将DNA 注入细菌中并进行复制，在复制过程中与细菌中的某些DNA 片段整合，然后噬菌体便可以携带细菌的DNA 片段进行再装配，当该噬菌体感染其他细菌时，便将自身携带的供体菌DNA 片段转移到受体菌内［22］。目前发现的副溶血性弧菌噬菌体只有vf12 和vf33 两种丝状噬菌体。对Vf12 和Vf33 基因组潜在的11 个开放阅读框（ORF）和4 个未知的基因区间（IG） 的进行预测，发现了8 个ORFs（vpf243，vpf402，vpf117，vpf81，vpf77，vpf491，vpf104和vpf380）在一个方向上转录，3 个ORFs（vpf261，vpf122 和vpf152）转录的方向与其相反。其中七个ORFs 和一个IG（vpf402，vpf117，vpf81，vpf77，IG3，vpf491，vpf104 和vpf380）的组成及氨基酸数量与霍乱弧菌的CTX 噬菌体中的6 个基因和一个IG 区间极为相似（rstA，rstB，cep，orfU，ace，zot 和IG）。虽然vf12 和vf33 具有携带耐药基因的能力，但目前仅发现它们与副溶血性弧菌的毒力有关，还没有发现耐药基因的水平转移［39］。

2．4．3 接合 接合是指供体菌和受体菌之间的通过性菌毛进行的遗传物质传递，它可以介导同种属或不同种属之间进行遗传物质的水平转移。携带耐药基因的质粒、整合子和整合元件等可通过接合转移实现不同细菌间的耐药基因的交换和进化［22］。

2015年首次在副溶血性弧菌中的IncA／C 型接合质粒上发现了blaCMY-2基因，进而确定了该基因可以进行细菌间的水平传播［40］。另外，在副溶血性弧菌中发现了携带编码PER-1 基因的IncN质粒，该基因为超广谱β-内酰胺酶基因，但PER-1在质粒上的遗传机制尚不清楚［38］。也有实验证明将抗诺氟沙星的副溶血性弧菌的pmvP36 质粒中的NorM基因导入大肠杆菌中，发现大肠杆菌对诺氟沙星，环丙沙星，卡那霉素，链霉素的抗性有所提升［41］。

目前在副溶血性弧菌中仅发现了1 型整合子。在副溶血性弧菌1 型整合子中已经确定了的基因盒有aadA1，dfrA1 和aacA3［42］。对β-内酰胺具有抗性的副溶血性弧菌中含有blaVEB的整合子，该整合子发现具有多重耐药区域（MDR）与qnrVC4 基因盒［43］。

1991年在南非的环境菌株中首次发现了ICE／R391家族整合性结合元件（integrative and conjugative element，ICE VpaChn1）［44-45］。将该整合元件敲除后，可导致敲除菌株对链霉素，新诺明等抗生素的抗性下降［46-47］，证明ICE 能够携带耐药基因并赋予临床和环境菌株的耐药性。它们存在于细菌染色体中，并且可以通过缀合再次切除，转移并整合到相容的新宿主染色体中。迄今为止，已经发现许多不同的ICE，SXT／R391 家族是弧菌属中最常见的，该整合元件在耐新诺明的副溶血性弧菌中被发现［48］。具有SXT／R391 的副溶血性弧菌对重金属镉、铜、锌和汞同样具有高度耐受性［49］。

3 展 望

美洲与欧洲的耐药率相对于亚洲和非洲比较呈现相对较低的状态，几乎所有国家分离得到的菌株都对氨苄西林耐药，在水产品中分离获得的副溶血性弧菌较水环境中分离得到的副溶血性弧菌耐药率较高，并且多重耐药菌株几乎均来自于水产品中（如牡蛎、贝类等），副溶血性弧菌对于弧菌属的推荐使用药物均有不同程度的抗性。

目前来看，副溶血性弧菌的耐药现状并不是很严重，但我们不能因此就掉以轻心，对于它的耐药机制和水平转移还有很多盲区。虽然目前还在使用抗生素治疗副溶血性弧菌感染，但由于副溶血性弧菌对弧菌属推荐使用的抗生素目前都呈现出不同程度的抗性，尤其对氨苄西林的抗性较高，近几年人们开始探索一些新的方法来进行抗生素的替代，例如在水中加入噬菌体、蛭弧菌、光合细菌或者其他益生菌，来进行环境副溶血性弧菌的消除，也可以对水生生物进行免疫激活剂的使用来提高它们自身的免疫力［50-51］。