光子晶体传感技术在临床快速检测中的应用进展

徐天依 宁保安 刘颖

(1内蒙古医科大学公共卫生学院，内蒙古 呼和浩特 010110；2军事科学院军事医学研究所环境医学与作业医学研究所)

目前，大部分临床检验都需要经过专业培训的工作人员使用专业仪器进行样品采集，测试和分析。配备这些专业人员费用较高，并且检测结果会受到由操作者错误造成系统误差的影响。这些临床实验室检测手段耗时，操作复杂，而且造价昂贵。因此，急需开发造价低廉，反应灵敏，快速，便携式，无需标记和易于操作的医疗检测工具。光子晶体(PC)是具有不同介电常数的周期性排列的材料，特殊的周期性的结构使它们具有很多独特的光学性质。当PC结构受到外界的刺激而变化时，其产生的光学现象也会随之改变。基于这一原理开发的PC传感器具有许多超越现有的其他竞争型生物传感技术的优点，比如制造方法简单，成本经济实惠和测定时间短。PC结构现已被用于检测多种生物样品中的生物标志物，如血液、尿液、汗液和眼泪等，其应用前景不可估量。

1 PC传感技术简介

PC结构是由介电材料在空间中周期性排列形成，这种特殊的结构会使电磁波受到入射光在介电边界处反射的影响而不能传播，即产生光子带隙(PBG)，这也是PC材料最主要的光学特征〔1〕。在应用中，PC结构可以在一维(1-D)，二维(2-D)或三维(3-D)方向上制造，包括微腔，波导，平板，多层薄膜及多孔规则几何形状〔2～6〕。一维PC(1D-PC)结构最为简单，其周期性仅存在于一个维度中，也被称为布拉格反射器或布拉格反射堆，它们只能特定地反射一种波长，通常通过逐层沉积，多次旋涂或光刻等技术来制备〔7〕。二维PC(2D-PC)结构的特征为其在两个空间方向上的周期性，主要通过复杂的自上而下方法制造，例如纳米压印光刻和电化学蚀刻技术等〔8〕。尽管2D-PC的沟槽和多孔结构为生物化学相互作用提供了更高的表面积，但当应用于临床样品时较大的生物分子(例如细胞)可能会在通道内聚集，甚至导致阻塞。三维PC(3D-PC)结构在立体三维中具有周期性。常见的3D-PC结构例如蛋白石PC和反蛋白石PC，这种称谓源于自然界中一类存在三维周期性结构的矿石，其表面十分光滑且具有炫目的虹彩色。制备3D-PC的方法有很多，其中化学自下而上的方法相对而言更经济简便，主要是通过纳米级的单分散微球进行自组装来构成PC主体，自组装法是利用了颗粒间相互作用的特性，例如静电斥力、磁力、惯性力和毛细现象等〔9〕。微球取材广泛，可以选择二氧化硅、氧化锌、二氧化钛或有机聚合物如聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯等〔10〕。3D-PC阵列是由存在于空气或溶剂等电介质中的电介质微球构成。将布拉格定律与Snell折射定律相结合可以发现，如果反射波长受化学或生物相互作用的刺激而改变，会使PC结构发生一系列光学现象变化，可以应用于传感检测〔11〕。微球中心距离和介质折射率是两个可导致反射波长变化的变量。两者经常同时变化，其中改变晶格间距通常更为容易，但利用折射率变化或单个光子晶体改变的传感器则具有更高的灵敏度和更快的响应时间，例如在PC中引入水凝胶制作反蛋白石PC〔12〕。PC表面受外部刺激引起有效折射率的变化，从而使共振波长峰值发生偏移，其偏移量可用于评价生物化学作用的情况。 目前PC结构在开发生物化学传感器领域已经获得了极大的关注，已被广泛应用于捕获，检测和量化各种生物分子，如病原体、核酸、蛋白质、酶、葡萄糖、细胞和癌症生物标志物等〔13～19〕。

2 PC传感技术在临床检测中的应用进展

2.11D-PC 1D-PC主要由材质不同的两种薄膜交替排列而成，由于其与光发生镜面反射，因此制作中不宜选用对光吸收较强和散射作用较大的材料。Bouzidi等〔20〕提出了一种基于1D-PC结构的生物传感器，用于监测血糖。该研究将1D-PC中两种材料的交替层中间的空层注满血液，血液层导致透射光PBG内出现电磁模式，其频率取决于血液中葡萄糖的浓度，进而达到了检测的目的。Sinibaldi等〔21〕报道了使用一种利用1D-PC与外部均匀介质之间的布洛赫表面波，结合荧光检测的光学平台，可对细胞裂解液中乳腺癌生物标志物ERBB2临床相关浓度进行检测，检测限为0.3 ng/ml(1.5 pmol/L)。另外Rizzo等〔22〕利用Bloch表面波特性设计了一种新型集成生物传感平台。作者将1D-PC直接沉积在低成本的一次性塑料生物芯片上，使用夹心免疫测定法检测缓冲液、细胞上清液和人血浆中的血管内皮生长因子(VEGF)，该平台在人血浆样品中检测到低至3.5 ng/ml的VEGF，且分辨率高，检测速度快(30 min)，并且与酶联免疫吸附测定结果非常一致。但1D-PC的结构相对简单，大部分情况下只作为传感元件，具体检测还需要依赖一些外部设备，如荧光检测等，这也限制了它在临床检测中的应用。

2.22D-PC材料 2D-PC的制造方式有很多，其中纳米压印光刻(NIL)是一种快速，简单且可扩展的图案转移技术，可替代需要昂贵设备和复杂操作的电子束光刻。在NIL方法中，首先在母模上使用深紫外或电子束光刻生成图案，然后可以轻松地将其转移到复制品上。Endo等〔23〕成功通过NIL技术制造了2D-PC聚合物，并将慢性阻塞性肺病(COPD)的生物标志物纤维蛋白原的抗原修饰在其表面，利用抗原-抗体的高灵敏度反应，使PC的衍射峰发生红移，即可在1 h内有效地无标记检测纤维蛋白原，检测限为100 pg/ml。另有Su等〔24〕根据涂覆金的2D-PC上局域表面等离子体共振(LSPR)的变化实现对载脂蛋白E4基因序列相关DNA的检测。这项研究中，作者使用了NIL方法在柔性共聚物膜上制造2D-PC结构，证明其具有制作应用于诊断方面的小型化和可穿戴式生物传感器的前景。目前NIL方法已被用于快速可靠地批量生产PC结构，然而由于磨损，单个模具可制备的复制品数量有限，模具的使用寿命也较短〔8〕。2D-PC结构也可以与水凝胶结合制作传感器，其优势在于①2D阵列和水凝胶可独立制造，2D阵列可以在聚合过程中附着在水凝胶表面上或嵌入水凝胶中;②传感器的响应可以通过测量德拜环而不是使用光谱仪来确定;③2D-PC传感器的读数是可靠的，因为来自2D材料的衍射光与折射率无关。高敏君等〔25〕将分子印迹技术与2D-PC水凝胶结合起来，制备了一种特异性检测红霉素的PC传感器，通过测量由于单色光垂直射入2D-PC结构而产生的德拜环的变化，来反映红霉素的浓度。另有一项研究，Chen等〔26〕提出了一种新型的凝胶化单层胶体晶体PC材料，用于监测泪液中的葡萄糖。研究者将二维组装的微球胶体包埋在4-硼苯甲醛修饰的聚乙烯醇(PVA)水凝胶中。当葡萄糖分子与硼酸盐结合时，PVA和硼酸根离子的比例发生变化，导致水凝胶体积改变，伴随着结构色明显转变。在180 s内，葡萄糖浓度从0变化到20 mmol/L，其结构颜色可以从红色变为黄色再变为绿色。作者进一步检测了眼泪中葡萄糖浓度，证明该传感器具有高精度和高灵敏度特征，这种智能传感材为进一步开发例如用于葡萄糖点监测的隐形眼镜等可穿戴医疗器材提供了一定的可能性。

2.33D-PC 3D-PC可分为孔洞型和非孔洞型材料，孔洞型材料主要指3D有序的多空穴材料，是指向堆垒好的胶体PC中灌入交联剂，通过紫外光照射等手段使交联剂发生交联，形成网络结构，再通过腐蚀或煅烧手段将胶体颗粒除去，形成具有有序结构的大孔材料。非孔洞型材料是指单分散的胶体颗粒在介质中周期性排列形成的PC结构。介质为空气时形成的结构称为胶体晶体，介质为单体水凝胶交联聚合时形成的结构称为胶体晶体有序阵列(PCCA)。Wu等〔27〕提出了一种蛋白石PC传感材料，可以无标记检测转铁蛋白(TRF)。由甲基丙烯酸甲酯和3-丙烯酰胺基苯基硼酸聚合而成的单分散微球，通过垂直沉降自组装，堆垒成PC，利用TRF与微球上硼酸基团的反应，制备成对TRF特异性响应的PC传感器，随着TRF浓度增加，衍射峰强度降低。TRF的检测限为2×10-3～200 ng/ml，并进行了模拟尿样中TRF浓度的测量，为临床诊断中的TRF测定提供了廉价且易于使用的替代方案。Elsherif等〔28〕将微工程光学漫射器结构压印在苯基硼酸官能化水凝胶薄膜中，漫射器使入射光聚焦在不同焦距和方向上，从而在透射和反射模式中读出漫射的光分布。由于苯硼酸可以可逆地与葡萄糖分子的顺式二醇结合，使水凝胶体积膨胀，改变其阵列原有秩序，进而改变水凝胶薄膜的焦距，因此可以测量通过传感器的透射光学光传播和强度，以确定生理条件下葡萄糖浓度的变化。作者将这种传感器集成在隐形眼镜中并放置在人造眼睛上。人工刺激葡萄糖浓度的变化可以使用智能手机的光电二极管进行定量测量。利用智能手机app将接收光强度转换为定量葡萄糖浓度值。这种检测方案可以设置在可穿戴实时生物标志物监测设备中以供护理点使用。Lee等〔29〕制备了基于SiO2的反蛋白石PC结构作为生物传感器。作者使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷，琥珀酰亚胺基-N-马来酰亚胺基丙酰胺基-四乙二醇酯作为交联剂制备了反蛋白石PC结构，然后利用蛋白G将抗体固定在其表面来捕获流感病毒。由于抗体抗原特异性结合造成有序大孔材料结构变化导致衍射峰的红移，可以通过监测反射光谱来无标记检测流感病毒。该材料在噬斑103～105单位(PFU)范围内显示出高灵敏度，并且对甲型H1N1流感病毒具有高度特异性。另外3D有序孔洞型材料还可以与记忆材料结合，通过多空穴的塌陷和复位来可逆的检测气体中的丙酮〔30〕，由于糖尿病患者呼吸中含有丙酮，该技术有望应用于糖尿病酮症酸中毒的监测。

3 结 语

临床上对生物分子的检测面临多重挑战，包括缺乏集中化实验室，技术能力有限，缺乏熟练员工及医疗保健管理系统较差(特别是在资源有限的环境中)等问题。基于PC的生物传感器代表了一类先进的新型光学生化传感器，可以一定程度上解决这些难题。PC材料可以通过简单的手段，使用便宜的原料如金属、氧化物、塑料、聚合物和玻璃等来大量生产。最近，PC结构已经与智能手机，柔性材料和可穿戴传感器等新兴技术相结合，这更提高了它作为诊断工具的利用率。但临床样品中通常包含细胞和组织等复杂的生物流体，这些可能干扰PC传感器的换能过程，并且一些PC结构目前只做到了定性检测，还需研发更精确的读出系统。虽然仍有很多难关尚未攻克，但PC材料应用于临床检测的前景不容小觑，这需要我们继续努力，开发出更加方便快捷，经济实用的临床医疗检测设备。