微流控芯片与基因诊断关系的研究进展

张晓杰 费洪新

(齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

微流控芯片(MC)也称为芯片实验室，其已经广泛于医学、生物、电子、流体、化学等领域〔1,2〕，且MC可把样品制备、反应、分离、检测、扩增、分析等集成到一块几微米至几百微米尺度的芯片上并自动完成所有基本过程。目前，MC已经广泛地应用到医学基因诊断(GD)方面，例如基因多态性检测〔3〕、基因高效性测序〔4〕、基因快速性扩增〔5,6〕等，为此，本文主要对MC与GD关系进行综述。

1 MC简介

1.1MC相关概念 MC主要是指在几微米至几百微米的通道内将系统化、规范化、程序化的操作单元集成到一块芯片上，且对微小体积的液体样品进行系统化、规范化、处理或操作的一门系统科学和技术〔7〕。微阵列芯片主要是指将一个或者多个相同或者相似的系统化、规范化、程序化的操作单元或单元群平行地集成在同一芯片上的一门系统科学和技术〔8,9〕。生物芯片主要是指将已经知晓的生物信息包括DNA与RNA核酸序列固定于经过表面修饰的载体上，以此进行特异性地检测未知DNA核酸序列、RNA核酸序列的一门系统科学和技术〔10,11〕。

1.2MC制备方法 实验室制备MC需要采用电子计算机辅助软件〔12，13〕设计出简易型或者复杂型的MC图纸，应用激光雕刻技术〔14,15〕在由聚二甲基硅氧烷、聚吡咯烷酮、线性聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、羟乙基纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酯等混合材料制备的双面黏性薄膜〔16〕上切割出微米级、纳米级的MC流体通道，将由聚二甲基硅氧烷制备的盖片、双面黏性薄膜、基片采用高温加热〔17,18〕的方式进行封接组装，然后将制备好的MC与注射器、注射泵、荧光倒置显微镜、图像记录仪等连接起来，以此就建立起MC反应系统，随后还需要进行MC表面修饰化、抗体固定化，其中前者多采用巯基-马来酰亚胺基团〔19〕硅烷化耦联法为MC表面修饰方法，而后者多采用链霉亲和素-生物素〔20，21〕亲合法进行抗体固定的优化，之后就可以进行MC的反应、分离、检测、扩增、分析。

2 MC与GD的关系

2.1MC与基因多态性检测的关系

2.1.1MC检测基因缺失 一般而言，基因缺失主要是指高等动物、低等动物基因由于受到体内外各种因素的干扰促使机体部分基因区域缺如，由此将会影响高等动物、低等动物的部分结构和功能。目前，MC可以将高等动物、低等动物基因的大片段缺失区域进行确定，例如X 染色体连锁的隐性遗传病抗肌萎缩蛋白基因的缺失，使用MC可以进行检测分析。国外一项研究显示，通过直接监控微流体平台单菌株生长，可以检测大肠杆菌菌株中的基因组缺失效应，与野生型菌株相比，清洁基因组菌株的平均生长速度下降、平均滞后时间延长，且个体细胞生长速度和滞后时间之间直接相关，会表明清洁基因组种群更加不均匀，可见单菌株MC可以揭示细微的单个菌株反应〔22〕。另外，使用MC系统能够将许多不同出芽酵母菌株高通量地开展研究，选择野生型芽殖酵母和62个不同芽殖酵母大小对照相对基因缺失株进行扫描，将可以获得不同基因缺失菌株的母细胞倍增时间、子细胞倍增时间、母细胞大小、子细胞大小等结果，可见MC可以对基因缺失进行基因诊断〔23,24〕。一项亚细胞水平研究报告显示，线粒体是人体和动物细胞的能量产生和代谢中心，为维持生理功能提供大部分能量，其在细胞死亡过程中发挥重要作用，但是其缺失有效的修复系统，线粒体DNA受到的氧化损伤要高得多，而使用MC还可以应用于线粒体DNA缺失的诊断，与传统的检测方法相比，MC系统开发的样品和试剂消耗较少，提取的线粒体DNA提取率较高，可以在150 min内自动化进行所有的检测过程，可见MC将为分析线粒体DNA缺失提供了一个有力的工具〔25〕。近年来国外一项研究显示，MC可以诊断非小细胞肺癌常规样本表皮生长因子受体(EGFR)基因缺失且显示非小细胞肺癌与EGFR外显子19缺失明显相关〔26〕。

2.1.2MC检测基因重排 基因重排主要是指高等动物、低等动物基因从远离启动子的地方且转移到距离启动子比较近的地方，从而促使各类动物基因重新启动转录的调控方式，其结合了传统诱变技术、细胞融合技术、基因突变技术等。研究显示，基因重排利于消化道淋巴瘤〔27〕和非小细胞肺癌〔28〕的诊断。国外研究显示，通常高等动物、低等动物T、B 恶性淋巴瘤多表现T 细胞受体(TCR)基因、免疫球蛋白(Ig)H基因高度表达，通过以DNA交联染料(YO-PRO)-1为荧光标记染料标记基因片段，经MC分析后可以明确单一IgH或TCR 基因重排方式，且明显节省检测时间，以此最终诊断出T、B 恶性淋巴瘤〔29,30〕。国外研究显示，拷贝数变异(CNV)将会导致基因组变异且是引起基因组重排的一种现象，通过MC结合微流体毛细管电泳可以有效地检测基因重排且此方法非常可靠〔31〕。

2.1.3MC检测微小卫星DNA 微小卫星DNA主要是指广泛存在于高等动物、低等动物基因组中长度100～500 bp多态性的DNA 序列且微小卫星DNA核心序列仅仅是2～5 bp，其也称为短串联重复(STR)〔32,33〕，使用MC检测可以积极克服传统的垂直板凝胶电泳背景模糊、费时费力、误差较大等，但是也有相对不稳定〔34〕的部分缺点，MC检测应用的范围非常广阔例如脆性X综合征(FraX)精氨酸编码的CGG STR序列、造血干细胞移植(HSCT)后可变数量串联重复序列(VNTR)〔35〕、法医鉴定所需的多重扩增STR基因座(DYS390、DYS393、DYS439)〔36,37〕等，这与通过STR来分析识别MC系统的快速化(3 h)〔38〕、模块化、集成化(同时检测17个STR)〔39〕的积极优势有一定关系。国外法医学资料研究显示，MC可以通过检测微小卫星DNA来进行法医筛选和基因分型，尤其是可以快速对那些在爆炸或恐怖事件附近被拘留的嫌犯、企图非法出入境的被拘留者、大规模灾害的受害者等人群，可见微小卫星DNA快速筛查就显得尤为重要，使用改进的Agilent 2100生物分析仪可以在80 s内检测6个微小卫星DNA，且精确度为0.09～0.21 bp、分辨率值为2.5～4.1 bp，可见MC检测微小卫星DNA具有快速化、准确化、高效化等基本特点〔40〕。

2.1.4MC检测基因突变 基因突变主要是指高等动物、低等动物受到各种因素的作用下，基因出现改变，包括单个碱基、多个碱基的改变，使用MC可以检测基因突变，例如秀丽隐杆线虫cwn-1突变〔41〕、循环系统肿瘤细胞基因突变〔42〕。一般而言，所有疾病相关基因逐渐被克隆基因突变包括单链构象多态性、限制性片段长度多态性所取代，其中，单链构象多态性〔43,44〕主要是指等长DNA单链出现单个碱基差异，随后由于链内彼此作用而形成构象差异，使用荧光染料标记引物，使用MC分析乳腺癌易感基因，可以在2 min内就可以对乳腺癌易感基因的单链构象多态性检测，这比毛细管电泳所需的时间要明显缩短；限制性片段长度多态性〔45,46〕是指某些特殊的点突变会促使某些特异性的限制性内切酶位点缺失，使用MC可以检测分析限制性片段长度多态性。国外研究资料显示，非小细胞肺癌样品进行表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的验证研究测试可以使用MC来进行，通过一种快速而灵敏MC技术可以将EGFR快速检测出来且成本低廉〔47〕。

2.2MC与基因高效性测序的关系 基因测序主要是指采用先进的方法对高等动物、低等动物核酸序列进行系统化、规范化、快速化分析〔48,49〕，此过程需要的工程量尤为巨大。目前，对MC实验室主要采用96根阵列毛细管电泳对基因序列进行系统化测定，虽在一定程度上加快了人类基因组项目，但是还不能实现高效、灵敏、快速、价廉、自动、准确等基本特点，而MC可以实现高效基因测序，例如肠道微生物基因测序〔50〕、酵母基因测序〔51〕、肺癌肿瘤细胞基因测序〔52〕等检测效率非常高。

2.3MC与基因快速性扩增的关系 基因快速性扩增通常是指采用聚合酶链反应(PCR)将目标靶点DNA片段呈倍数量增加并通过电泳方式将目标靶点DNA片段识别、分离、分析等〔53，54〕，此过程有需要较多的试剂、加热时间长、冷却时间长等缺点。目前，在实验室内基因快速性扩增可采用MC，通过将MC与PCR结合，以此建立起微型化的MC-PCR反应体系，将会明显克服PCR的缺点包括PCR需要较多的试剂、加热时间长、冷却时间长等，同时MC-PCR反应体系扩增产物很容易与样品分离且可实现检测的自动化、集成化、微型化。目前，MC-PCR反应体系可以检测土壤细菌基因〔55〕、肿瘤细胞基因〔56〕、血液细菌基因〔57〕等，足见其应用十分广阔。

综上，MC可以应用到医学GD方面，例如基因多态性检测、基因高效性测序、基因快速性扩增等，可见MC与GD均是密切相关的，推测使用MC将是今后GD检测分析的新方法之一。