工厂化栽培浅黄色金针菇杂交菌株选育初探

张根伟 谷雨泰，2 刘振国 刘昆昂 刘 萌 李书生* 董 杰

（1河北省科学院生物研究所，河北石家庄050081；2北京市第二中学，北京东城100010）

金针菇（Flammulina velutipes）又名构菌、冬菇、毛柄金钱菌等[1]，按子实体颜色可将金针菇分为黄色金针菇和白色金针菇[2]。黄色金针菇是我国传统金针菇生产品种，相对于白色金针菇，具有抗性强、产量高、营养价值高、口感脆爽等特点[3]。有研究表明，黄色金针菇蛋白质、赖氨酸等含量远高于白色金针菇，这可能是黄色金针菇风味、口感优于白色金针菇的原因[4]。黄色金针菇外观深黄、基部褐色重，品相较差，子实体经常出现菌柄向上弯曲、菌盖开伞、颜色过深等现象，影响了其商品性。目前，黄色金针菇因其出菇不整齐、产量低等问题，未有工厂化生产。为此，笔者进行黄色金针菇与白色金针菇杂交菌株选育，以期筛选适合工厂栽培的浅黄色金针菇品种。

1 材料与方法

1.1 供试材料

杂交亲本：黄色金针菇品种“新苏6”（XS6），为提纯复壮菌株，具有高产、早熟、抗逆性强的特点；白色金针菇品种“金杂15”（Z15），为抗病性较强的杂交新菌株。以上菌株均为河北省科学院生物研究所提供。

病原菌：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），河北省科学院生物研究所分离。

PDA培养基为马铃薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。谷粒母种培养料配方为谷子99 g，石膏1 g。含水量58%，pH自然。

栽培培养料配方为木屑30%，玉米芯20%，棉籽壳20%，麸皮15%，米糠15%。料含水量65%，pH自然。

1.2 选育方法

1.2.1 单核菌株分离筛选

分别取两亲本菇形完整、长势旺盛、接近成熟的子实体，于无菌环境下剪去菌柄，将有菌褶一面平贴在灭菌平皿上，过夜，收集孢子[5]。用无菌水稀释孢子至2×104个/mL（血球计数板法），取50µL孢子液涂布于PDA平板中，25℃黑暗中倒置培养6～7 d，在平板上肉眼可见微小菌落后，用接种针挑单个菌落转接于PDA平板上，继续培养。在菌落外缘挑小菌丝块压水玻片于400倍显微镜下观察菌丝有无锁状联合，菌丝无锁状联合的为所需单核菌株。在4℃条件下保存备用[6]。

1.2.2 单核菌株杂交配对

选取生长旺盛的两亲本单核菌株，在PDA培养基中进行两两相互配对杂交，25℃培养10～15 d。取菌丝刮片，400倍显微镜下观察有否锁状联合。将具有锁状联合的杂交双核菌株，转入PDA试管，25℃培养，备用（即筛选出的供试杂交菌株，下同）。

1.2.3 杂交菌株特性考察

1.2.3.1 菌丝生长速度测定

使用直径90 mm的培养皿，每皿用定量蠕动泵加入35 mL PDA培养基。在培养皿平板中心接入供试杂交菌株，25℃培养菌丝满皿后，用直径为0.5 cm的打孔器打孔制备菌饼。将菌饼接入PDA培养基平板中央，置于25℃恒温培养箱中培养，每个处理设3个重复。3 d后划线，记录菌丝生长天数和测菌落半径，计算菌丝生长速度。以亲本为对照。

1.2.3.2 抗铜绿假单胞菌能力测定

使用直径90 mm的培养皿，每皿用定量蠕动泵加入35 mL PDA培养基。在培养皿平板中心接入供试杂交菌株，25℃培养满皿后，用直径为0.5 cm的打孔器打孔制备菌饼；同时活化铜绿假单胞菌菌种。将制备的菌饼接种到距离平板中心1.75 cm处，对称接入铜绿假单胞菌，在25℃条件培养7 d。观察记录菌丝生长及拮抗情况，测量拮抗线的宽度[7]。以亲本为对照。

1.2.3.3 出菇试验

出菇试验在临西县天和食用菌开发有限公司[8]。将供试杂交菌株及亲本菌株接入谷粒母种培养基，25℃培养15 d制成母种。将母种接入装有灭菌栽培料的1100 mL规格塑料瓶中，每瓶装湿料约750 g，每个菌株重复16瓶。前期培养温度18～20℃，后期培养温度12～16℃，空气相对湿度55%～65%；待菌丝长满栽培瓶后，刮除瓶口表层菌丝进行搔菌；搔菌后的栽培瓶移入出菇房，初始温度17℃，维持5 d，然后逐步降低温度，原基形成后，保持温度8～10℃，空气相对湿度85%～95%，CO22000 mg/kg。当子实体高出瓶口2～3 cm时套筒，每天150 lx光照8 h，连续光照2 d，CO22000～9000 mg/kg，待菌柄长至16～18 cm采收。统计子实体分枝数、测产量，观察记录子实体颜色。

1.2.4 菌株的ITS鉴定

采用真菌ITS序列通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）对样品进行扩增。PCR反应体系：2.5 µL 10×PCR Buffer、2 µL dNTP、引物分别加入0.5µL、0.5µL Taq DNA 聚合酶、0.5µL DNA模板，用水补至25µL。PCR扩增条件：94℃2 min，94℃ 40 s，52℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环，72℃5 min，将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测[9]。采用PCR纯化试剂盒EP101（北京全式金生物科技有限公司）对扩增产物进行纯化。采用试剂盒CT301（北京全式金生物科技有限公司）将纯化后的PCR产物连接T3载体，挑阳性克隆接种于液体LB培养基中培养6 h，验证阳性克隆，将阳性克隆菌液送至华大基因进行测序，所得序列与NCBI数据库中已知序列进行比对，采用MEGA 6软件，通过临近法构建系统发育树。

1.2.5 数据处理

采用Excel2007处理数据，获得均值及标准差。采用SPSS2.0软件中Duncan检验方法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 杂交结果

从黄色金针菇“新苏6”中分离鉴定出单孢菌株15个，白色金针菇“金杂15”中分离鉴定出单孢菌株5个。进行两两相互配对杂交，共配对杂交组合75个，以锁状联合为标记鉴定杂交菌株，确定杂交菌株37个，杂交成功率为49.3%。

2.2 杂交菌株特性

对37个杂交菌株菌丝生长速度测定和抗病原铜绿假单胞菌能力测定，其中生长速度显著高于亲本的杂交菌株有13个，详见表1。由表1可知，病原铜绿假单胞菌可以强烈抑制金针菇菌丝的生长，拮抗带越窄金针菇抗性越强（图1）。菌丝生长速度快的13个菌株，抗病原铜绿假单胞菌能力均强于亲本，排在前5位的分别为F9、F2、F14、F6和F1。

表1 亲本与杂交菌株菌丝长速及抗菌能力

2.3 出菇试验结果

13个杂交菌株工厂化栽培出菇试验结果见表2。由于生理“吐水”严重，出菇过程中采取了3次倒水操作，F6和F12由于“吐水”过多，未能正常出菇。由表2可知，杂交菌株子实体均为黄色，其中8个菌株子实体颜色较黄色亲本“新苏6”颜色浅。产量处前3名的杂交菌株为F1、F17和F9，分别为296 g/瓶、278 g/瓶和271 g/瓶，分别比亲本“新苏6”提高39.6%、31.1%和27.8%。从吐水量和产量关系看（图3、表2），除F8以外，吐水量和产量呈负相关。

图1 亲本和4个杂交菌株与病原铜绿假单胞菌拮抗情况

图2 杂交菌株子实体

表2 杂交菌株出菇情况

2.4 菌株ITS真实性分析

图3 金针菇产量和“吐水”量比较

ITS序列是真菌基因组rDNA的内转录间隔区，位于18S和5.8S rDNA以及5.8S和28S rDNA之间，在物种属内、近缘属间乃至科内系统进化关系研究中有一定的价值。采用ITS1和ITS4引物序列对筛选出的金针菇杂交菌株及亲本进行PCR扩增，获得大小为823～844 bp的片段（图4）。选择Lentinula edodesL9作为外围，如图5所示，F1与F17亲缘关系最近，F9与F1、F17、F33亲缘关系次之，选育出的金针菇F1、F17、F9菌株与亲本Z15和XS6并未聚集在一类，为不同于亲本的新菌株。

图4 金针菇杂交菌株及亲本的ITS电泳

图5 基于ITS序列构建的金针菇的系统发育树

3 小结与讨论

出菇试验发现，黄色金针菇和白色金针菇在菌丝生长阶段的差异主要为：黄色金针菇在栽培料中菌丝生长粗壮，生长快，搔菌后至原基形成阶段易出现生理“吐水”现象。工厂化立瓶栽培金针菇，出现“吐水”过多，会把刚形成的原基淹没，导致原基缺氧死亡。因此，笔者认为严重的生理“吐水”现象是黄色金针菇工厂化栽培不成功原因之一。

试验选育出的大多数杂交菌株子实体颜色比黄色亲本浅（图2），抗病原铜绿假单胞菌能力、产量介于两个亲本之间，同时发现产量与“吐水”量大体呈负相关；筛选出的F1、F17及F9杂交菌株子实体颜色浅黄，抗性强，“吐水”少，产量高于黄色金针菇亲本。试验为进一步杂交选育适宜工厂化栽培产量高、品质好黄色金针菇奠定了基础。