内蒙古四个毒丝盖伞形态学及rDNA-ITS鉴定

田慧敏 尹 元

（赤峰学院生命科学学院，内蒙古赤峰024000）

丝盖伞属（Inocybe）隶属担子菌门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（Agaricales）[1]。该属的形态特征主要为子实体较小，多为斗笠状菌盖，深肉桂色至锈色，有鳞片，伸展后菌盖中间部分凸起，边缘部分易开裂。菌肉白色。菌褶直生至近延生，淡锈色，褶缘白色。菌柄多为圆柱形，近白色，内部实心，表面有褐色鳞片。孢子淡锈色，表面光滑，近椭圆形。囊状体有或无，有的顶端有结晶。菌盖及菌柄表皮多为整齐排列的菌丝[2]。该属的成员都为外生菌根菌，与阔叶林和针叶林形成外生菌根，特别是山毛榉、桦木、杨树等形成外生菌根，促进树木的发育，不仅提高木材的产量和质量，具有经济效益，而且具有较高的环境效益，在生态系统中起重要作用。由于丝盖伞属种类、外形因环境不同变化大、种内变异丰富、分类鉴定难度较大，导致资源利用、中毒救治等方面受限，因此传统的形态特征分类鉴定有一定的局限性和主观性。20世纪90年代开始国内外菌物学家在大型真菌分子鉴定的方法上做了许多尝试和探讨，ITS以其快速、准确、简便等优点在大型真菌鉴定中得到了迅速的发展和广泛应用，ITS已大量用于对丝盖伞属的鉴定、系统发育及亲缘关系分析中[3-8]。笔者采用形态学和ITS片段测序技术相结合的鉴定方法对赤峰市不同地区五个丝盖伞属的真菌进行鉴定，力求探索丝盖伞属真菌的准确鉴定方法，为真菌的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试4个标本均由笔者于2016、2017年采集于赤峰市不同地区，CFSZ11663（赤峰市松山区神仙沟风景区杨树林地，东经 118°18′～118°19′，北纬42°06′30″～42°08′30″）、CFSZ13074（赤峰市松山区城子乡盔甲山风景区油松林地）、CFSZ10362（赤峰市巴林右旗赛罕乌拉国家级自然保护区樟子松林地，东经118°18′～118°55′，北纬43°59′～44°27′）、CFSZ11344（赤峰市翁牛特旗五分地镇巴林桥杨树林地。采集的标本在拍摄生境照片、观察形态、测量数据、自然干燥、编写号码、超低温冷冻等系列处理之后存放于赤峰学院生科院菌物标本室（CFSZ）。

1.2 形态鉴定

采用宏观特征和显微结构的鉴定方法，宏观特征采用肉眼观察、游标卡尺测量等方法，需要测量供试样本的新鲜子实体大小、颜色、菌柄长度以及直径、菌盖直径。查阅大量文献进行检索、比对、定种；显微结构在光学显微镜（奥特BED203）下观察和测量孢子、担子、囊状体、锁状联合、菌盖表皮、菌柄表皮菌丝形态及大小等，所有数据均测量20个，用显微照相系统（Olympus BX53）拍摄显微结构相片。

1.3 ITS鉴定

1.3.1 DNA的提取

取干样品子实体菌盖的一小部分研磨，称量30 mg使用基因组DNA提取试剂盒完成对基因组DNA的提取。

图1 华美丝盖伞子实体形态及微观结构

1.3.2 PCR扩增、纯化及测序

PCR扩增反应在PCR扩增仪（eppendorf 5331）上进行。

经引物ITS1/ITS4进行50µL体系PCR扩增后，在1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。样品PCR扩增之后的产物用Takara胶纯化试剂盒纯化后，交由生物科技公司完成测序[9]。

1.3.3 ITS序列比对分析

将得到的ITS序列，通过Chromas软件拼接，在GenBank数据库中进行ITS序列的Blast比对，从检索的结果里挑选出同源性比较高的ITS序列，利用MEGA5.1软件构建系统发育树，发育树的每个分支统计学显著性分析以最大似然法进行检验，重复次数为1000次。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

经形态学鉴定，CFSZ11663为华美丝盖伞Inocybe splendensR.Heim，CFSZ13074为污白丝盖伞Inocybe geophylla（Bull.）P.Kumm.，CFSZ10362 为 斑纹丝盖伞Inocybe maculataBoud.，CFSZ11344为茶褐丝盖伞Inocybe umbrinellaBres.。

2.1.1 华美丝盖伞Inocybe splendensR.Heim（内蒙古新记录种）

子实体偏小;菌盖直径1.7～2.0 cm，斗笠状，深棕色，中间部分颜色较深，表面具呈放射状纵条纹的纤毛；菌褶弯生，浅灰棕色；菌柄长3.0～4.4 cm，粗0.2～0.7 cm，乳白色至浅棕色（图1，a、b）。

孢子（9.5～12.0）µm×（5.0～9.0）µm，纺锤形，表面光滑，无色（图1，c）；担子（30.5～34.0）µm×（11.0～12.5）µm（图 1，d）；侧生囊状体（55.0～98.0）µm×（24～33.5）µm，腹鼓状，囊状体顶端有结晶（图1，e）；菌盖表皮部分菌丝无色，有隔膜，具分支，直径13.0～19.0 µm，盖面囊状体直径28.5～33.5 µm（图1，f、g）；菌柄表皮部分菌丝无色，有隔膜，直径测量得7.0～9.0µm，具锁状联合（图1，h）。

该种主要特点为菌盖棕色，具黄褐色放射状纤毛，褶侧囊体很大，长达98µm，菌盖表皮菌丝膨大呈腹鼓状宽达34µm。属华美组SectionSplendentes鳞毛亚组 supersection“Marginatae”[10]，该种分布于吉林，其他地区未见报道，为内蒙古新记录种[11]。

2.1.2 污白丝盖伞紫色变种Inocybe geophyllavar.lilacina（Peck）Gille

子实体偏小，菌盖直径1.2～1.8 cm，斗笠形，污白色具紫色光泽，中部呈现黄色，边缘为齿状；菌肉白色；菌褶锈色，直生或弯生，着生较密，菌褶不等长；菌柄长3.7 cm，粗0.2 cm，灰白色，较为光滑（图2，a、b）。

孢子（7.0～11.5）µm×（4.0～7.0）µm，近椭圆形，表面光滑，淡锈色，有内含物（图2，c）；担子（26.0～34.0）µm×（9.5～12.0）µm，无色，棒状，具四个小梗（图 2，d）；囊状体大小为（50.0～62.5）µm×（12.0～23.0）µm，囊状体壁厚，顶端有结晶（图2，e）；菌盖表皮部分菌丝无色，整齐排列，具隔膜，有分支，具锁状联合，直径7.0～10.0 µm（图2，f、g）；菌柄表皮部分菌丝整齐排列，无隔膜，有锁状联合，直径6.5～8.5 µm（图2，h）。

该种为污白丝盖伞Inocybe geophylla的变种。主要特点是菌盖呈淡紫色，菌盖表皮菌丝不膨大，锁状联合多，其他特征均一致。该种于1972年被描述定种为Inocybe geophyllavar.lilacina[12]，在我国广泛分布。

图2 污白丝盖伞紫色变种子实体形态及微观结构

图3 斑纹丝盖伞子实体形态及微观结构

2.1.3 斑纹丝盖伞Inocybe maculataBoud.

子实体较大，菌盖直径7～8 cm，斗笠形，黄色，有条纹，干后变锈色，边缘有残留的菌幕；菌褶浅灰棕色，等长，干后变为锈色，遇KOH变黑锈色；菌肉白色；菌柄长度为9 cm，粗约0.8～1 cm，淡黄色，中生（图3，a、b）。

孢子（7.5～9.5）µm×（5.5～7.0）µm，椭圆形，表面光滑，无色，非淀粉质（图 3，c）；担子（21.6～31.2）µm×（7.2～10.1）µm，无色，棒状，具四个小梗（图3，d）；没有囊状体；菌盖表皮部分菌丝无色，隔膜均匀，具锁状联合，直径6～6.8µm，有膨大菌丝，直径14.4～31.2 µm（图3，e）；菌柄表皮部分菌丝整齐排列，无色，有隔膜，直径6.8～16.4µm。

该种主要特点是菌盖边缘具有白色菌幕残留，褶侧囊体无[13-14]，属于Inosperma亚属裂盖组Rimosae组[15]。

2.1.4 茶褐丝盖伞Inocybe umbrinellaBres.

子实体中等大小，菌盖直径约4.2 cm，斗笠形，中间部分凸起，顶部茶褐色，边缘色浅，有棕色片状鳞片；菌肉白色；菌褶棕色至锈色，不等长，较疏，着生方式为弯生；菌柄长度为10.2 cm，粗约0.4 cm，土黄色，基部膨大（图4，a、b）。

孢子（9.6～12）µm×（5.3～7.2）µm，椭圆形，表面光滑，锈色，有内含物，非淀粉质（图 4，c）；担子（23.6～34.1）µm×（9.1～11.8）µm，无色，棒状，具四个小梗（图4，d）；褶侧囊体和褶缘囊体均无，菌盖表皮部分的菌丝无色，存在膨大细胞（74.4～108）µm×（24～48）µm，其余菌丝整齐排列，具均匀隔膜，直径7.7～12.3µm（图4，e）；菌柄表皮部分的菌丝整齐排列，无色，有隔膜，直径8.4～14.9µm。

图4 茶褐丝盖伞子实体形态及微观结构

图5 供试样品和Genbank的最相似物种的ITS序列构建系统发育树

该种主要特点是菌盖具有褐色片状小鳞片，无囊状体，菌盖表皮膨大，最宽可达48µm[16]。在我国分布广泛。

2.2 rDNA-ITS测序鉴定结果

2.2.1 四个丝盖伞属真菌样品的ITS测序结果

PCR扩增的4个样品DNA的ITS序列，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，可得出CFSZ11663约为680 bp，登录号为MG367267；CFSZ13074 约为710 bp，登录号为 MG367268；CFSZ10362 约为600 bp，登录号为MG367269；CFSZ10460 约为680 bp，登录号为MG367270；CFSZ11344 约为700 bp，登录号为MG367272。

2.2.2 系统发育树分析结果

对 4个样本11663、13074、10362、11344的 ITS序列及与其高度相似的序列构建系统发育树。

结果表明：与5个供试标本相似的20个来自Genbank最相似的序列均为丝盖伞属（Inocybe）。其中11663与Inocybe splendens聚在一起，结合宏观特征和微观结构将标本11663鉴定为华美丝盖伞（Inocybe splendensR.Heim）。13074与Inocybe geophylla聚在一起，结合宏观特征和微观结构将标本13074鉴定为污白丝盖伞紫色变种[Inocybe geophyllavar.lilacina（Peck）Gille]。10362 与Inocybe maculata聚在一起，结合宏观特征和微观结构将标本CFSZ10362鉴定为斑纹丝盖伞（Inocybe maculataBoud.）。11344与Inocybe umbrinella聚在一起，结合宏观特征和微观结构将标本11344鉴定为茶褐丝盖伞（Inocybe umbrinellaBres.）（图5）。

3 小 结

研究将分子鉴定与形态鉴定相结合，二者的鉴定结果基本吻合，11663鉴定为华美丝盖伞Inocybe splendensR.Heim，13074鉴定为污白丝盖伞紫色变种Inocybe geophyllavarlilacina（Peck）Gille，10362鉴定为斑纹丝盖伞Inocybe maculataBoud.，11344鉴定为茶褐丝盖伞Inocybe umbrinellaBres.。其中Inocybe obsoletaRomagn为中国新记录种，污白丝盖伞紫色变种Inocybe geophylla，斑纹丝盖伞Inocybe maculataBoud.，茶褐丝盖伞Inocybe umbrinellaBres.为有毒菌类，误食后会产生神经精神型症状。研究为菌物资源的鉴定及安全开发提供依据，为有毒菌类的准确鉴定提供了方法。rDNA-ITS序列分析的应用随着分子生物技术的快速发展，会有更广阔的发展前景，为真菌的研究提供更加快速、准确的鉴定方法。