柴朴汤对哮喘大鼠肺组织MAL/MAPK/ERK通路的影响*

刘鑫，刘穆华，罗淑瑛

[1.南华大学附属第一医院（南华大学第一临床学院） 中医科，湖南 衡阳 421001；2.湖南省娄底市中心医院 呼吸内科，湖南 娄底 417000]

哮喘是一种具有多种发病机制的疾病，与过敏有关，是遗传和环境相互作用的结果，哮喘被定义为气道慢性炎症[1]。细胞外调节蛋白激酶（ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的一种，可以在很多细胞中表达，ERK1/2是ERK的一种亚型，已证明主要分布在气道平滑肌细胞上。研究发现ERK1/2通路参与哮喘气道慢性炎症及黏液分泌等过程[2]。而前期研究发现哮喘患者血清能诱导MAL表达下调，而柴朴汤含药血清能使之表达增加，减轻哮喘的炎症反应[3-4]。但柴朴汤是否能调控MAPK/ERK通路，减少炎症因子的分泌，目前尚未有研究报道。因此，本实验旨在研究柴朴汤是否能通过影响T细胞成熟相关蛋白（MAL）及MAPK/ERK通路的表达来改善哮喘的炎症反应症状，为柴朴汤治疗哮喘提供更多的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

健康雄性SD大鼠，体重（220±20）g，40只，购于南华大学动物部。卵蛋白（OVA）（美国Sigma公司），氢氧化铝干粉（Al（OH）3）（广州化学试剂厂），中药配方颗粒（广东一方制药有限公司），PD98059（深圳欣博盛生物科技有限公司），兔抗p-ERK多克隆抗体（武汉博士德生物技术公司），MAL抗体（北京博奥森），PCR引物、动物总RNA快速提取试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（上海碧云天研究所）。JSC-OK超声波雾化器（辽宁省鞍山仪器厂），封闭雾化箱（自制），低温超速离心机（德国Eppendorf公司），凝胶成像分析仪（美国Alpha公司），PCR仪（广州华粤公司）。

1.2 哮喘模型的复制

将40只大鼠按随机数字表法随机分为4组：哮喘组、柴朴汤组、柴朴汤+MAPK/ERK通路抑制剂（PD98059）（柴抑组）、对照组，每组10只。适应性喂养1周，按照参考文献[5]复制哮喘模型。除对照组外，其余各组均予以OVA 1 mg+Al（OH）3100 mg+生理盐水混合液1 ml于第1和8天腹腔注射致敏。自第15天开始，置于自制的雾化箱中，用雾化器将1% 1 mg+Al（OH）3 100 mg+生理盐水雾化吸入激发30 min，隔天1次，共8周。以大鼠出现呼吸节律紊乱、耳、尾及口唇紫绀、不喜活动代表模型复制成功。对照组用生理盐水代替。在哮喘组基础上，自第15天开始，柴朴汤组每次雾化前30 min予以柴朴汤（1.5 g/kg）2 ml灌胃，柴抑组每次雾化前30 min予以PD98059（3 mg/kg）[6]腹腔注射，同时给予柴朴汤（1.5 g/kg）2 ml灌胃。末次雾化24 h后，予以10%水合氯醛1 ml腹腔注射麻醉，腹主动脉放血处死大鼠，用RT-PCR检测肺组织中MAL mRNA的表达，免疫组织化学（简称免疫组化）检测MAL、p-ERK1/2蛋白在肺组织中的表达。

柴朴汤由柴胡（产品批号5090141）、半夏（批号 50933781）、黄芩（批号505020T）、茯苓（批号5092201）、厚朴（批号412390T）、大枣（批号 5083021）、甘草（批号5090751）、白参（批号504321T）、苏叶（批号412149T）、生姜（批号5074131）等中药配方颗粒组成，由广东一方制药有限公司提供，按7∶5∶3∶3∶3∶3∶2∶2∶2∶1比例配制，1 g颗粒相当于生药6.8 g。生理盐水冲泡，现配现用。

1.3 实验方法

1.3.1 病理学观察 用4%中性甲醛固定肺组织后，取内中带的肺组织行常规石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜观察肺组织的形态。

1.3.2 RT-PCR检测MAL mRNA的表达 按一步法提取肺组织总RNA，引物的设计与合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。β-actin引物：PCR正向 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，反向 5'-CTC CTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，产物长度500 bp；MAL：正向 5'-AACAAAGTGGGAGATTGAGACCTA-3'，反向5'-GTATGGCTGGATAACCAAAGG-3'，产物长度185 bp。总反应体系为20 μl。β-actin反应参数：95℃预变性10 min，94℃变性5 min，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，循环35次，最终72℃延伸5 min，4℃临时保存。MAL的反应参数：95℃预变性10 min，94℃变性5 min，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，循环40次，最终72℃延伸5 min，4℃临时保存。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，用Image J软件分析各电泳条带灰度值，以β-actin作为对照，对各组MAL mRNA进行分析。

1.3.3 免疫组化检测MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的表达 按照试剂盒说明书操作：脱蜡、增加水分、密封、滴加MAL、p-ERK1/2、IL-4一抗、加二抗孵育、DAB显色、苏木素复染。在光学显微镜下观察，棕黄色颗粒代表阳性，测量阳性颗粒的光密度（optical density, OD），计算其平均值代表MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组病理组织学改变

哮喘组大鼠肺组织可见大量炎症细胞（以嗜酸性粒细胞为主）浸润，皱襞增多，上皮坏死、脱落，杯状细胞黏液化生明显，平滑肌及基底膜增厚，管壁增粗，管腔狭窄。柴朴汤组、柴抑组上述病变较哮喘组均有所减轻。对照组肺组织结构正常，气道上皮完整，无明显炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组肺组织病理学改变 （HE×200）

2.2 各组大鼠肺组织中MAL mRNA的表达

实验结果显示，β-actin的电泳条带在500 bp处最亮，各组mRNA条带亮度大致相当。在185 bp处可见MAL mRNA电泳条带，哮喘组mRNA条带最暗，柴朴汤组、柴抑组、对照组依次增亮。见图2。

哮喘组MAL mRNA的表达最少，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；柴朴汤组和柴抑组均高于哮喘组，差异有统计学意义（P＜0.05）；柴朴汤组和柴抑组两组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

图2 MAL mRNA的电泳图

表1 各组大鼠肺组织中MAL mRNA的相对灰度值（±s）

表1 各组大鼠肺组织中MAL mRNA的相对灰度值（±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与哮喘组比较，P ＜0.05

组别 n MAL mRNA哮喘组 10 0.30±0.011）柴朴汤组 10 1.00±0.031）2）抑制剂组 10 1.00±0.071）2）对照组 10 1.70±0.13 F值 189.118 P值 0.000

2.3 各组大鼠肺组织中MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的表达

免疫组化结果显示，4组大鼠均可见MAL蛋白阳性的棕黄色颗粒细胞，哮喘组MAL 蛋白的表达最少，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；柴朴汤组和柴抑组均高于哮喘组（P＜0.05）；柴朴汤组和柴抑组两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3和表2。

对照组未见明显p-ERK1/2蛋白阳性棕黄色颗粒，其余各组大鼠均可见p-ERK1/2蛋白阳性棕黄色颗粒，主要位于支气管上皮细胞、平滑肌细胞。哮喘组p-ERK1/2蛋白表达最多，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；柴朴汤组和柴抑组均低于哮喘组（P＜0.05）；柴抑组低于柴朴汤组（P＜0.05）。见图4和表2。

图3 各组大鼠MAL蛋白的表达 （免疫组化×200）

图4 各组大鼠p-ERK1/2蛋白的表达（免疫组化×200）

表2 各组大鼠肺组织中MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的平均光密度值 （±s）

表2 各组大鼠肺组织中MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的平均光密度值 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与哮喘组比较，P ＜0.05；3）与柴朴汤组比较，P ＜0.05

组别 n MAL p-ERK1/2 IL-4哮喘组 10 0.30±0.031） 0.60±0.031） 1.50±0.041）柴朴汤组 10 0.60±0.051）2） 0.40±0.061）2） 0.60±0.091）2）柴抑组 10 0.70±0.061）2） 0.20±0.012）3） 0.40±0.041）2）3）对照组 10 1.1±0.06 0.1±0.03 0.1±0.02 F值 348.506 112.737 568.622 P值 0.000 0.000 0.000

哮喘组IL-4蛋白表达最多，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；柴朴汤组和柴抑组均低于哮喘组（P＜0.05）；柴抑组低于柴朴汤组（P＜0.05）。见图5和表2。

图5 各组大鼠IL-4蛋白的表达 （免疫组化×200）

3 讨论

支气管哮喘是一种慢性炎症性肺部疾病，近几十年来全球发病率一直在上升。目前临床治疗哮喘的主要药物是糖皮质激素，它主要能降低炎症细胞的聚集及炎症介质的表达，但长期使用容易并发感染，甚至诱发激素抵抗。而中药可以减慢哮喘的加重，使哮喘患者的病情好转，减少因糖皮质激素的不良反应。中医认为哮喘主要的发病机制是外因触发，痰堵气道，痰气交阻[7]。柴朴汤由小柴胡汤和半夏厚朴汤组成，有理气、减轻气道重构的作用，是针对发病机制治疗哮喘的有效方剂。

MAL最初由ALONSO等[8]在T细胞分化晚期发现，是一种高度疏水蛋白，位于细胞外围，参与上皮细胞的吸收和分泌。研究表明，MAL在多种肿瘤细胞（如乳腺癌、胃癌、宫颈癌及头颈鳞状细胞癌）中均有表达，它能稳定上皮细胞的极性，从而抑制肿瘤细胞的发育和转移[9-10]。MAL还可以通过维持宿主器官的屏障功能而起到保护宿主的作用。屏障主要是指由细胞结合于黏膜上从而形成的紧密连接的线性排列，是具有保护作用的隔离层，屏障功能破坏将导致炎症及细菌的扩散。而哮喘炎症反应的源头是上皮细胞损伤以及修复机制受损[11]，进而上皮细胞的稳定性减弱，屏障功能被破坏。前期已经通过基因研究证实，哮喘大鼠模型中MAL基因的表达下调，且时间越长其表达约低，说明MAL在哮喘的起病及进展中起着重要作用[12]。而柴朴汤通过使MAL的表达上调，进而使哮喘大鼠气道更加稳定，症状随之减轻[3]。

ERK是一类常见的蛋白激酶，是MAPKs成员之一。ERK包括ERKl和ERK2，活化后的ERK1/2即为p-ERK1/2，其进入细胞核后作用于ATF、AP-1、TNF等炎症因子，启动基因的转录和翻译，从而诱导促炎因子与炎症介质的合成与释放[13]。研究发现，ERK1/2信号通路参与哮喘的病理发生、发展过程，其可使哮喘的气道炎症和气道重塑过程加重[14]。杨红菊等[15]使用低氧培养箱培养人气道上皮细胞复制细胞低氧模型中，发现p-ERK1/2水平增加，黏蛋白MUC5AC过度生成和分泌，提示低氧可以诱导ERK1/2通路的激活，导致气道黏液高分泌，表明ERK1/2通路涉及气道炎症及气道黏液分泌过程。张元元等[16]实验表明，IL-33通过ERK1/2信号通路促进哮喘小鼠的气道重塑，阻断ERK1/2信号通路，可使哮喘的病变减轻。前期研究已经证实，柴朴汤可以抑制哮喘大鼠肺组织中ERK信号通路的表达，从而减少平滑肌细胞产生纤维连接蛋白，进而抑制哮喘气道重塑及气道炎症的发生、发展[17]。

研究发现，Th1/Th2细胞的失衡与哮喘发病密切相关[18]。而Th2细胞分泌的IL-4，其在哮喘的发病机制中起着重要的作用。IL-4能够促进Th细胞向Th2分化。它能刺激B细胞活化、增殖，产生抗体，从而参与体液免疫应答，如调控B淋巴细胞，使其产生特异性IgE。IgE能够结合在嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞或血小板的特异性受体上，当同种抗原再次暴露时，抗原与细胞表面特异性IgE交联，从而导致炎症释放的链式反应[19]。

本研究结果显示，哮喘组MAL mRNA和蛋白的表达最低；而在柴朴汤组和柴抑组中MAL mRNA和蛋白的表达均高于哮喘组，且肺组织病变较哮喘组减轻；柴朴汤组和柴抑组比较无差异。哮喘组MAL表达最低，柴朴汤能够使MAL表达上调，进而减轻哮喘大鼠的炎症细胞浸润情况，这与笔者前期研究的结果一致。而MAPK/ERK通路抑制剂PD98059对MAL的表达无抑制作用，说明MAL是ERK通路的上游信号因子。另外，在哮喘组中，p-ERK1/2蛋白的表达高于对照组，提示在哮喘状态下ERK1/2被磷酸化激活，ERK通路参与了哮喘的起病过程。而p-ERK1/2蛋白的表达在柴朴汤组和柴抑组中均低于哮喘组，说明柴朴汤能抑制ERK1/2的磷酸化，减轻哮喘的气道炎症，延缓哮喘的加重。同时，哮喘组大鼠IL-4蛋白表达最高，与对照组比较有差异。而柴朴汤及抑制剂干预后，IL-4表达减少。且柴抑组下降更明显，提示柴朴汤能够抑制IL-4的表达，其可能是通过ERK通路实现的。

本研究结果表明，柴朴汤可以上调哮喘大鼠肺组织中MAL的表达，进而抑制MAPK/ERK信号通路，减少IL-4的表达，从而减轻哮喘炎症反应，这可能是柴朴汤治疗哮喘的机制之一。