叶酸受体α高表达与浆液性卵巢癌患者生存率的相关性研究

符吉芬，裴雄越，王爱丽

（海南省海口市中医院 妇产科，海南 海口 570102）

卵巢癌是致死率高的妇科恶性肿瘤，其无明显病理特征、早期诊断困难及缺乏精确肿瘤标记等都是造成卵巢癌预后非常差的原因[1]。其中浆液性卵巢癌占卵巢癌的50%，因此寻找新生物标志物对于卵巢癌治疗方案评估与预后非常重要。

肿瘤抗原125（carcinoma antigen 125, CA125）是最常用于监控卵巢癌患者对治疗反应的一种生物指标[2]。但CA125的升高也可见于一些良性的状况（如子宫内膜异例、子宫肌瘤或盆腔炎等[3-4]。叶酸参与细胞内代谢与DNA合成、修复，是正常细胞与肿瘤细胞的必需维生素。叶酸受体α（alpha-folate receptor，FR-α）分子量为38～40 kD的细胞膜蛋白，容易与氧化叶酸结合，在正常细胞中不表达，大量表达于各种非黏液性（non-mucinous）上皮组织肿瘤细胞中（如卵巢癌）。但是FR-α在肿瘤细胞中高表达机制仍不清楚，一般认为是肿瘤在发展过程中用来调控从血清中摄取的叶酸量，或参与信号调控作用[5-7]。本研究主要分析FR-α在浆液性卵巢癌中表达的临床意义，探讨其作为浆液性卵巢癌生物标志物和治疗靶点的潜能。

1 资料与方法

1.1 一般研究

选取2005年1月—2010年12月海口市中医院接受分期手术与减积手术的91例浆液性卵巢癌患者，除Ia期及高分化患者，其他患者接受分期手术或减积手术后，接受4～6次以铂类药物为基础的化疗。患者年龄、绝经状态、术前CA125含量、治疗史、减积手术时疾病状态及复发与生存率等临床参数均来自患者医疗、外科及出院记录。术后残留肿瘤最大直径≤1 cm时，便将此次减积手术定义为理想减积手术，否则归类为次理想减积手术。本研究通过医院伦理委员会审查通过，患者签署知情同意书。

1.2 随访

术后前2年，患者每隔3个月来院复查1次。复查项目包括病史询问、骨盆与直肠检查和局部淋巴结触诊；2年后每半年复查1次。每次复查检测患者血清CA125含量与宫颈涂片检查。一旦怀疑复发，则进行CT与MRI检查。影像检查显示异常征象、腹水细胞学分析结果异常及2周1次肿瘤指标检查结果连续2次≥正常最高值的2倍或是组织切片发现肿瘤细胞，则认为疾病复发。

1.3 卵巢癌肿瘤组织FR-α表达的检测

标本离体后30 min内取材，迅速置于液氮中冷冻于-80℃冰箱冷冻保存。提取总RNA，鉴定其浓度、纯度及完整性。FR-α引物序列：正向5'-ACCCAG AAGACTGTGGATGG-3'，反向 5'-TGCTGTAGCCAAAT TCGTTG-3'。探针序列：FAM5'-ACTGCTGTCATGCC GTGCCCCTCT-3'TAMR（FAM和TAMR为探针两端发光基团）。GAPDH引物序列：正向5'-CCGGACTAGA CTGAGCCAGACGGAGAGC-3'，反向5'-CCGGAATTC GCAGGGATTTCCAGGTATCA-3'；探针序列：FAM5'-ACTGCTGTCATGCCGTGCCCCTCT-3'TAMR。反应条件：50℃复温2 min，95℃预变性10 min，循环1次；95℃变性15 s，60℃退火1 min，95℃延伸15 s，循环40次；60℃终末延伸1 min，循环1次。反应结束后用ABI prism 7000 SDS Software进行标准曲线拟合并计算各目的基因拷贝数，FR-α基因相对表达量为FR-α基因拷贝数与内参GAPDH基因拷贝数的比值。

1.4 CA125检测

清晨空腹取血5 ml，分离血清，采用流式荧光发光法检测癌胚抗原，仪器为上海透景生命科技有限公司生产的流式荧光发光仪TELLGEN，使用厂家配套试剂。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，卵巢癌患者临床特征与术前血清CA125含量、FR-α表达量关系用Kruskal-WallisH检验及Mann-WhitneyU检验，组间比较用χ2检验；Kaplan-Meier生存曲线分析患者生存率，并进行Log-rank检验；采用Cox回归单因素和多因素分析无病生存率（free disease survival, FDS）和总生存率（overall survival, OS）的影响因素，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 浆液性卵巢癌患者临床特征与术前血清CA125含量、FR-α表达量的相关性

91例浆液性卵巢癌患者随访中位时间为19个月（5～78）个月，确诊时患者年龄中位数为55岁（41～66岁）。91例患者中包括4例FIGO I期、6例FIGO Ⅱ期、65例FIGO Ⅲ期、16例FIGO Ⅳ期，其中40例患者（44%）术后残余肿瘤直径≤1 cm，术前血清中CA125含量中位值1 402 u/ml，卵巢癌组织中FR-α表达量为0.652。

晚期和接受次理想减积手术患者卵巢癌组织FR-α表达量高于早期或是接受理想减积手术患者。术前晚期卵巢癌患者CA125血清含量高于早期患者（P＜0.05），但接受理想减积手术和次理想减积手术患者与早、晚期手术患者血清CA125含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

2.2 影响FDS的Cox逐步回归分析

单因素分析显示，FIGO分期、肿瘤分化程度与淋巴结转移并不影响到患者FDS。即使将患者以术前CA125含量1 000 u/ml为阈值分为两组，CA125也与FDS无关。但是单因素分析显示，患者不能接受理想减积手术、患者接受治疗后63 d血清中CA125含量不能降至正常值以下（＜35 u/ml）、卵巢癌织FR-α高表达3个因素与患者较FDS相关。多因素分析发现，血清中CA125在患者接受治疗63 d后无法降至正常值以下与卵巢癌组织FR-α高表达是FDS的危险预后因子（P＜0.05）。见表 2、3。

2.3 影响OS的预后因子分析

单因素分析表明FIGO分期、肿瘤分化程度与淋巴结转移与否对OS无影响。术前CA125含量≥1 000 u/ml对OS也无影响。然而未接受理想减积手术、患者血清CA125接受治疗后63 d未降至正常值以下、FR-α高表达与OS相关。多因素分析显示，患者血清中CA125接受治疗后63 d未降至正常值以下和FR-α高表达是OS的危险预后因子。见表4、5。

将患者分为FR-α高表达组（FR-α/GADPH≥1.0）和FR-α低表达组（FR-α/GADPH＜1.0，比较两组FDS和OS后发现，FR-α高表达时，FDS更短见附图。2.073（1.051，4.084），P=0.043]和 OS 更差

表1 91例浆液性卵巢癌患者临床特征与术前血清CA125含量、FR-α表达量关系分析 [M（P25，P75）]

表2 卵巢癌患者FDS影响因素的单因素分析

续表2

表3 卵巢癌患者FDS影响因素的多因素分析

表4 卵巢癌患者OS影响因素的单因素分析

续表4

表5 卵巢癌患者OS影响因素的多因素分析

附图 FR-α表达与浆液性卵巢癌患者生存状况的关系

3 讨论

CA125是目前公认的卵巢癌标志物，也是卵巢癌术前评估的重要指标。然而，CA125对早期浆液性卵巢癌的敏感度相当低[8]。除肿瘤分期，组织学类型、肿瘤分化程度及是否接受理想减积手术，都是能够影响卵巢癌患者的预后因子[9]。与以往关于卵巢癌恶性度研究类似，本研究结果表明，术前患者CA125血清含量不能作为预估患者是否可以接受理想减积手术的标志物。此外，本研究发现晚期卵巢癌患者卵巢癌组织FR-α高表达。TOFFOLI等研究也表明，晚期卵巢癌患者FR-α表达高于早期患者，提示FR-α在卵巢癌发生、发展过程中发挥重要作用[10]。本研究还发现，FR-α高表达与患者无法接受理想减积手术无关。P53及M2-PK等其他生物标志物也与患者是否能接受理想减积手术相关。因此，联合检查该生物标志物评估卵巢癌患者是否能接受理想减积手术是潜在的研究方向。

虽然FR-α在肿瘤细胞中的作用仍不清楚，FR-α在卵巢癌、肾脏癌及肝癌与乳癌等多种非黏液性恶性肿瘤中异常高表达。此外，FR-α也是肿瘤抗原之一，约70%左右的卵巢癌或者乳癌女性会对FR-α产生免疫反应。因为细胞膜蛋白酶与糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、D结合，使表达于细胞表面的可溶解FR-α释放。然而，MANTOVANI等研究表明，只有41%患者能在血清中检测到FR-α。KALLI等则报道72%上皮卵巢癌患者（浆液性为81.7%，内膜样为66.7%，透明细胞型为63.3%，黏液癌为22.2%）中FR-α阳性反应。但是目前尚无检测α-FR表达的标准方法，因此本研究采用管家基因GAPDH表达量作为基准评估FR-α基因的表达量。

FR-α高表达与浆液性卵巢癌生存率呈负相关。本研究结果显示FR-α高表达患者FDS和OS较差。进一步分析，以α-FR/GAPDH比值1.0为临界值时，比值＜1的患者FDS和OS更短。KALLI等则研究表明，FR-α状态与卵巢癌复发时间或者整体生存率无关。造成研究结果不一致的原因可能是，本研究将患者限定为浆液性卵巢癌患者，而KALLI等的研究中则包含其他各种组织学类型，如浆液性，黏液性与透明胞癌等。因此，未来仍需收集大样本卵巢癌患者分析FR-α表达能否作为卵巢癌的预后因子。

研究表明，CA125降至正常值以下的时间与卵巢癌预后密切相关。本研究与以往研究均为发现术前血清CA125含量与预后相关。但本研究与其他研究结果都显示出血清CA125降至正常值以下的时间是卵巢癌患者治疗响应率和生存率的预后因子。本研究表明卵巢癌患者开始化疗后，血清中CA125在63 d内消退至正常范围（＜35 u/ml），则患者FDS与OS更长。因此，血清中CA125下降越快提示卵巢癌细胞对化学药物敏感度越高。

FR-α是卵巢癌治疗的潜在生物标志物，目前化疗依旧是治疗晚期卵巢癌的主要方法。卵巢癌易对化疗药物产生抗药性，因此选择个性化的化疗方案对卵巢癌治疗具有重要意义。由于FR-α具有组织特异性，可以在肿瘤治疗过程中以FR-α为载体将细胞毒性药物靶向运送至肿瘤细胞，从而避免对其他非肿瘤细胞和组织造成副作用。研究人员最近也使用与叶酸结合的治疗药物（如小分子化学药物、负载药物的脂质体及反义寡核苷酸与免疫制剂等）都成功的将药物运送至FR-α阳性反应的肿瘤细胞，以达肿瘤治疗效果。由于FR-α在多种癌症中均呈现高水平表达，且目前没有标准、统一的检测方法，且本研究属于小样本量研究，故仍需进一步在大样本中深入研究FR-α在卵巢中的价值。

综上所述，FR-α高表达的浆液性卵巢癌患者FDS和OS较短。确认FR-α表达能否作为卵巢癌存活率的生物预后标志物，仍需要在大样本量中研究证实。