miRNA-135b对鼻咽癌细胞侵袭和转移的促进作用

牛善利，满敏，牛传贵

（山东省滕州市中心人民医院 耳鼻喉科，山东 滕州 277500）

鼻咽癌（nasopharvnx cancer, NPC）是一种与EB病毒感染有关，发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤。发病以男性居多，男性发病率约是女性发病率的2倍。NPC多在30岁以后开始发病，50～59岁发病人数最多，60岁后趋于平缓[1]。目前研究表明NPC的miRNA是一种非编码RNA，在自然界广泛分布，长度一般为22个核苷酸。miRNA对肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，关于miRNA-21、miRNA-135b和miRNA-141对癌细胞的作用已有一些报道，张彦兵等在一项肝癌研究中预测发现miRNA-135b的4个靶基因大型肿瘤抑制因子同源蛋白2（large tumor suppressor, homolog 2, LATS2）、转录因子β-Trcp（β-transducin repeats containing proteins, β-TrCP）、人源下游调节因子2（N-mycdown-streamregulator 2，NDR2）和亮氨酸拉链肿瘤抑制基因（leucine zipper putative tumor suppressor 1, LZTS1），并通过分析发现该基因均以不同的方式参与Hippo信号通路的活性状态，从而调节相关蛋白的表达[2]，但miRNA-135b对鼻咽癌相关研究的报道较少[3]。MURAKAMI等研究发现，恶性间皮瘤细胞株的LATS2基因表达缺失，由此推断LATS2编码的丝氨酸参与肿瘤抑制信号通路，其失活会诱使恶性间皮瘤细胞的增殖[4]。本研究通过检测miRNA-135b对鼻咽癌CNE1细胞迁移和侵袭能力的影响，研究miRNA-135b的分子机制，为今后鼻咽癌的诊治提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶（购自美国Thermo Scientific公司），胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（购自北京元亨圣马生物技术研究所），鼻咽癌CNE1细胞及鼻咽部永生化上皮细胞NP69系（购自南京科佰生物细胞库），LipofectamineTM2000、Trizol试剂（购自苏州拜吉氏生物科技有限公司），microRNA逆转录试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司），RTPCR试剂盒（购自上海博谷公司），Transwell小室（购自美国Corning公司），基质胶（购自美国BD公司），LATS2 m Ab（购自美国Cell Signaling Technology 公司），ECL发光试剂盒（购自美国Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用RPMI 1640培养基培养鼻咽癌CNE1细胞系，培养基加链霉素与青霉素，浓度分别为150 u/L及150 mg/L，在37℃、50 ml/L二氧化碳CO2的培养箱静置培养，每3～4天用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。鼻咽部永生化上皮细胞NP69系接种于含10%胎牛血清的新鲜成分确定的无血清培养基中培养。

1.2.2 逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）检测miRNA-135b的表达 采用RNA提取试剂提取鼻咽癌细胞株及正常鼻咽上皮永生化细胞中总RNA，测定浓度，置入-80℃冰箱冷冻保存。采用SYBR Green法检测miRNA-135b的相对表达，反应的循环参数：95℃预变性12 min，95℃变性35 s，60℃退火 30 s，70℃延伸35 s，共40个循环，最后71℃延伸9 min。该步骤重复3次。

1.2.3 引物设计及细胞转染 在网站（http：//www.sanger.ac.uk/soft ware/Rfam/mirna）获取人miRNA-135b的序列，设计其序列特异性引物，通过NCBI BLAST检索程序排除其他的同源序列。扩增鼻咽癌CNE1细胞基因组DNA中的miRNA-135b的前体序列。PCR扩增的正、反向引物分别为5'-ATCGCTTGCACTGCAG GGACTGTCG-3'及5'-TCACGTTTCTGGAAACCAGC ACCGC-3'。构建miRNA-135b的干扰载体并提取质粒。转染前18 h，对扩增的鼻咽癌CNE1采用胰蛋白酶消化处理，调整细胞数为104个/孔。共设3组，试剂对照组、空载体对照组和转染组。运用LipfectamineTM2000转染试剂盒进行转染，转染后继续培养48 h，提取RNA，测定浓度，逆转录为cDNA。通过RT-PCR检测miRNA-135b基因的表达，以上的实验操作重复3次。

1.2.4 Wertern blotting检测目标LATS2的表达Wertern blotting检测过表达和干扰miRNA-135b的鼻咽癌CNE1细胞及对应对照组细胞中LATS2的表达。过表达miRNA-135b的鼻咽癌CNE1细胞和干扰miRNA-135b的鼻咽癌CNE1细胞及各对照组细胞经，低温裂解40 min，高速离心20 min[3]，BCA定量法测定总蛋白浓度，采用110 V电压进行电泳并恒压转移蛋白至PVDF膜，20℃封闭80 min加入小鼠抗人LATS2 mAb（1∶500），4℃过夜，室温封闭1 h；采用化学发光试剂曝光显影，超高灵敏度化学发光成像系统成像。对Wertern blotting检测结果进行半定量分析，LATS2的表达水平标准化后，计算转染组细胞中该蛋白的表达[5]。

1.2.5 Transwell实验检测鼻咽癌CNE1细胞侵袭能力 Transwell基质胶上胶准备完成后，在4℃下放置12 h[6]。采用无血清培养基37℃恒温水化45 min；比较过表达miRNA-135b的鼻咽癌CNE1细胞（过表达组）与空载体细胞（空载体组），及干扰miRNA-135b的鼻咽癌CNE1细胞（干扰组）与空载体细胞（对照组）的侵袭能力。对4组细胞进行消化处理，调整细胞悬液浓度为2×105个/ml；下室加入细胞悬液800 μl。37℃、5% CO2培养箱恒温培养12 h；清理干净后进行染色，并在200倍显微镜下随机取15个视野计数。

1.2.6 LATS2活性检测 胰酶消化转染48 h后，按照20 μl每100万细胞的比例加入裂解液，采用水浴法裂解细胞，4℃离心机，15 000 r/min离心12 min，取上清液。按照LATS2活性检测试剂盒的操作说明书检测实验组和对照组的LATS2活性变化[7]。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-135b在鼻咽癌CNE1细胞系的表达

CNE1细胞系miRNA-135b相对表达量为（4.85±0.41），而NP69细胞系相对表达量为（1.87±0.15），两者比较差异有统计学意义（t=5.813，P=0.014），miRNA-135b在鼻咽癌CNE1细胞系中的表达较NP69细胞高。

2.2 miRNA-135b不同表达程度对鼻咽癌CNE1细胞侵袭和转移的影响

过表达组与空载体组比较，差异有统计学意义（t=6.212，P=0.012），过表达miRNA-135b的鼻咽癌CNE1细胞的侵袭和转移能力有所增加（见图1A～B）。Transwell实验结果显示，干扰组与对照组细胞比较，差异有统计学意义（t=9.330，P=0.001），干扰组鼻咽癌CNE1细胞的侵袭和转移能力减弱（见图1C～D）。

2.3 LATS2活性及表达

转染24 h后LATS2蛋白的活性检测结果显示，空载体组与过表达及干扰组比较，差异有统计学意义（t=8.351，P=0.002）；对照组与干扰组比较，差异有统计学意义（t=5.420，P=0.011），LATS2的活性在过表达miRNA-135b的鼻咽癌CNE1细胞降低，而在干扰miRNA-135b的鼻咽癌CNE1细胞中增强，见图2。Wertern blotting结果显示，过表达miRNA-135b的鼻咽癌CNE1细胞中LATS2的表达水平有所下降，而干扰该miRNA后的鼻咽癌CNE1细胞中LATS2的表达水平有所增强，见图3。

图1 miRNA-135b不同表达程度对鼻咽癌CNE1细胞侵袭和转移的影响 （×40）

图2 LATS2的活性

图3 各组鼻咽癌CNE1细胞中LATS2蛋白的表达水平

3 讨论

miRNA是一种可促进癌症发生或者抑制癌症发生的基因调节因子，在控制细胞生长、分化及凋亡等生物学过程中发挥着重要的作用[8]，目前已有多种miRNA被发现与癌症有关，其中miRNA-135b被证明在多种肿瘤细胞中的表达均出现异常。miRNA-135b在结肠癌、肝癌、骨肉瘤等癌症中均被发现呈高表达状态[9]。多项研究表明，LATS2为抑癌基因，在肿瘤的发生和调节人类细胞周期中起到关键作用。作为LATS家族的新成员，LATS2在多种肿瘤组织中都为表达抑制或基因突变，然而在鼻咽癌组织中却为过度表达，从而抑制鼻咽癌细胞的生长，诱导其凋亡。ZHANG等[10]在鼻咽癌鼻咽上皮用生化细胞株N96中检测出LATS2的过度表达，提示LATS2可能在鼻咽癌组织中发挥促进癌细胞生长的作用。

本研究结果显示，miRNA-135b在鼻咽癌CNE1细胞系中高表达，可能导致鼻咽癌CNE1细胞侵袭和转移能力增强。Transwell实验表明，miRNA-135b的过表达提高鼻咽癌CNE1细胞的侵袭和转移能力，而对miRNA-135b进行干扰后，鼻咽癌CNE1细胞的侵袭和迁移能力下降。与miRNA-135b在其他癌症的细胞实验中的结果一致[5]。

有研究表明，miRNA-135b参与肿瘤发生、发展的机制可能与Hippo信号通路，而LATS2基因是Hippo信号通路的相关基因[11-13]，LATS2具有抑癌作用，本研究通过对鼻咽癌CNE1细胞miRNA-135b的过表达和干扰发现，LATS2的活性和表达水平在过表达miRNA-135b的鼻咽癌CNE1细胞降低而在干扰miRNA-135b的鼻咽癌CNE1细胞中增强。说明miRNA-135b的表达可能通过影响LATS2活性影响鼻咽癌细胞的生长。

综上所述，miRNA-135b的过表达可以引起鼻咽癌CNE1细胞的侵袭和转移能力增强，影响鼻咽癌细胞浸润扩散，并可通过调节LATS2的活性和表达水平来调控癌变和恶性程度。干扰miRNA-135b可抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭和转移。miRNA-135b在鼻咽癌的侵袭和转移中可能起着重要的调节作用，通过调节LATS2或许能够入核调控鼻咽癌的发生和恶性程度，但详细的机制有待更进一步的研究。