尼古丁对A549化学治疗敏感性的影响*

史夏青，刘玲，王成志，廖明媚，杨满意，赵劲风

（中南大学湘雅医院 卫生部纳米生物技术重点实验室，湖南 长沙 410008）

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居于癌症的首位，其发病率在许多发展中国家迅速上升[1-2]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌，占肺癌病例约85%[3]。近些年肺癌治疗已经在分子诊断和靶向治疗方面取得进展，但其临床治疗效果仍然很差，5年生存率低于15%[4]。长期吸烟是导致肺癌发生及耐药的主要因素，尼古丁（Nicotine）是香烟烟雾中的主要成分，其可以通过调控细胞内各种不同信号通路来促进癌细胞增殖，并对化学治疗（以下简称化疗）药物导致的癌细胞凋亡起抑制作用[5]。本研究探讨Nicotine对人肺腺癌细胞A549化疗敏感性以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bak和Mcl-1表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

A549细胞（上海中国科学院细胞库）。顺铂（cisplatin, CDDP）、Nicotine、MTT（美国Sigma公司），RPMI 1640培养基和青、链霉素（美国Gibco公司），胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）[依科赛生物科技（太仓）有限公司]，DMSO（北京索莱宝科技有限公司），Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司），一抗 p-Mcl-1（T163）、Mcl-1、Bak、GAPDH 和 二 抗（美国Cell Signaling Technology公司），Bcl-2（英国Abcam公司），BCA试剂盒（美国赛默飞公司）。细胞培养箱（日本SANYO公司），FACS-Canto流式细胞仪（美国BD公司），全波长酶标仪（美国BioTek Epoch公司），电泳仪（美国BIORAD公司），Fluor Chem R多功能成像分析系统（美国Protein Simple公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞培养于含10%FBS，1%青霉素和链霉素，RPMI-1640培养基，37℃，5%二氧化碳培养箱。

1.2.2 MTT法检测细胞活力 将对数生长期的A549细胞接种于96孔板，每孔5 000个细胞，每组3个复孔。待细胞贴壁后，在有或无Nicotine处理的条件下，加入含有不同浓度CDDP（0.0、2.5、5.0、10.0、20.0及40.0 μmol/L）的培养基，继续培养48 h。同时设空白组（只含有等量培养基）和对照组（含同数量细胞和等量培养基），每孔加入10μl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h，每孔加入100 μl DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪490 nm处测量各孔的吸光值。

1.2.3 Annexin V/PI检测细胞凋亡 取处于对数生长期的A549细胞，调整细胞密度为1×104个/ml，以2 ml/孔接种于6孔细胞培养板，加入5 μmol/L Nicotine处理2 h，加入含有7 μmol/L CDDP的培养基继续培养48 h后，收集细胞并使用冷的PBS缓冲液洗细胞2次，再用1×Binding Buffer缓冲液制成100 μl的1×106个/ml的细胞悬液，加入Annexin V与PI轻轻混匀，室温20～25 ℃避光处放置15 min后，加入1×Binding Buffer缓冲液400 μl，1 h内上流式细胞仪测定结果。

1.2.4 Western blotting检测凋亡相关蛋白 收集处理后的细胞，提取细胞总蛋白，10%的SDS-PAGE凝胶电泳，250 mA转膜至PVDF膜，5% BSA封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光显影。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Nicotine作用A549后对CDDP敏感性的影响

5 μmol/L Nicotine处理A549细胞2 h后，不同浓度的（0.0、2.5、5.0、10.0、20.0及 40.0 μmol/L）CDDP分别处理A549细胞48 h，CDDP能降低A549细胞的存活率，且具有剂量依赖性,随着浓度增加细胞存活率逐渐降低（P＜0.05）。CDDP+Nicotine组的细胞存活率较CDDP组的细胞存活率高。见表1。

2.2 Nicotine与CDDP对A549细胞凋亡的影响

对照组、CDDP组和CDDP+Nicotine组的细胞凋亡率分别为（3.94±1.15）%、（14.75±2.17）%和（9.53±0.86）%。经方差分析，差异有统计学意义（F=38.626，P=0.000）。CDDP组 和CDDP+Nicotine组细胞凋亡率均大于对照组（P＜0.05）；CDDP组 和CDDP+Nicotine组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），CDDP+Nicotine组的细胞凋亡率降低。见图1。

表1 CDDP和CDDP+Nicotine对A549细胞存活率的影响 （n =3，%，±s）

表1 CDDP和CDDP+Nicotine对A549细胞存活率的影响 （n =3，%，±s）

注：1）与 0.0 μmol/L 比较，P ＜0.05；2）与 CDDP 组比较，P ＜0.05

组别 0.0 μmol/L 2.5 μmol/L 5.0 μmol/L 10.0 μmol/L 20.0 μmol/L 40.0 μmol/L F值 P值CDDP组 1.00±0.08 70.77±0.331） 55.41±2.601） 39.49±3.211） 31.37±2.421） 23.22±3.221） 237.987 0.000 CDDP+Nicotine 组 1.00±0.08 77.02±1.971） 71.03±2.371）2） 52.44±3.061）2） 35.58±1.841）2） 29.89±5.561） 60.985 0.000

图1 Nicotine与COPD对A549细胞凋亡影响

2.3 Nicotine对A549的凋亡相关蛋白表达水平的影响

结果见图2和表2、3。5 μmol/L Nicotine处理A549细胞不同时间（0.0、0.5、1.0及2.0 h）后，A549细胞的p-Mcl-1、Mcl-1、Bcl-2和Bak的表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 Nicotine影响A549的凋亡相关蛋白的表达水平

表2 5 μmol/L Nicotine处理不同时间后对A549细胞凋亡相关蛋白的表达 （n =3，±s）

表2 5 μmol/L Nicotine处理不同时间后对A549细胞凋亡相关蛋白的表达 （n =3，±s）

注：†与0.0 h处理组比较，P ＜0.05

蛋白 0.0 h 0.5 h 1.0 h 2.0 h F值 P值p-Mcl-1 5.48±2.34 23.65±3.37† 34.24±1.73† 65.65±2.71† 273.899 0.000 Mcl-1 41.62±2.00 63.73±2.80† 87.44±4.03† 97.50±2.91† 98.699 0.000 Bcl-2 9.33±1.00 17.05±1.15† 23.51±0.87† 34.21±2.26† 38.323 0.000 Bak 6.15±0.27 6.16±0.39 6.24±0.39 6.39±0.22 0.335 0.801

表3 Nicotine和CDDP联合处理后A549细胞凋亡相关蛋白的表达 （n =3，±s）

表3 Nicotine和CDDP联合处理后A549细胞凋亡相关蛋白的表达 （n =3，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与CDDP组比较，P ＜0.05

组别 p-Mcl-1 Mcl-1 Bcl-2 Bak对照组 23.02±1.76 94.26±1.55 25.52±3.64 7.15±2.13 CDDP 组 15.58±1.251） 21.84±1.931） 9.42±0.641） 13.55±2.711）CDDP+Nicotine 组 22.18±1.841）2） 88.21±4.501）2） 70.38±3.741）2） 15.05±0.391）F值 23.830 52.811 41.143 96.150 P值 0.001 0.000 0.000 0.000

Nicotine和CDDP联合处理后，CDDP+Nicotine组A549细胞的p-Mcl-1、Mcl-1、Bcl-2和Bak的表达，CDDP组较对照组的p-Mcl-1、Mcl-1、Bcl-2的表达均降低，Bak的表达升高。较CDDP组p-Mcl-1、Mcl-1、Bcl-2的表达均升高，Bak的表达无变化。

3 讨论

肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤，超过乳腺癌，前列腺癌和结肠癌的总和[6]。到目前为止，许多治疗手段，如手术、放化疗、免疫治疗和其他一些有针对性的方法已应用于肺癌治疗[7]。CDDP是用于治疗各种人类恶性肿瘤最有效和广泛使用的DNA损伤抗癌药物之一。然而，目前肺癌患者往往会对CDDP产生耐药性，导致化疗失败[8]。因此，更好地了解肺癌中CDDP耐药的分子机制对于肺癌的靶向治疗和改善肺癌患者的预后非常必要。

吸烟是肺癌最大的危险因素，约占非小细胞肺癌的70%和小细胞肺癌的90%[9]。Nicotine是烟草中的主要成分，可致癌且令人上瘾[10]。最近的报道显示Nicotine抑制各种肺癌细胞凋亡，这暗示Nicotine不仅具有促进肺癌细胞增殖的能力，也可通过降低化疗药物的功效来促进肺癌细胞生存[11]。笔者的研究表明，Nicotine确实可以降低肺癌细胞A549对化疗药物CDDP的敏感性，减少化疗过程中的肺癌细胞凋亡。

Bcl-2、Bak和Mcl-1是Bcl-2基因家族的成员，Bak是主要促凋亡蛋白，在细胞凋亡中发挥重要作用。Mcl-1的半衰期较短，只有0.5～3.0 h。因此，延长Mcl-1蛋白半衰期对其长期促生存功能至关重要。Mcl-1蛋白可以在T163位点磷酸化，其磷酸化可以延长Mcl-1的半衰期，增强抗凋亡功能。A549细胞经Nicotine处理后，Nicotine不仅上调Mcl-1的表达水平，还增强其T163位点磷酸化水平。因此，Nicotine促进A549细胞的增殖，还降低其化疗敏感性可能通过上调Bcl-2和Mcl-1的表达，以及Mcl-1的T163位点磷酸化水平。进一步的实验研究可以探讨Mcl-1是否可以作为肺癌靶向治疗的靶点或候选基因。

有研究证明Nicotine可以从肺癌细胞的乙酰胆碱受体上取代乙酰胆碱，并激活PI3K、Akt、MAPK、PKC等蛋白激酶，引起Bcl-2家族部分蛋白的表达及其磷酸化情况发生变化[12-14]。而Nicotine是否通过激活PI3K、Akt、MAPK、PKC等蛋白激酶和Bcl-2家族蛋白诱导肺癌细胞耐药尚不明确，进一步探索Nicotine诱导肺癌细胞耐药的分子机制可为肺癌治疗发现新的治疗靶点，为肺癌的治疗提供新的治疗策略。