分子生物学技术应用于野生动物保护及扩散研究概况

刘 旭 丁由中

(1.国家海洋局海岛研究中心，平潭，350400；2.华东师范大学生命科学学院，上海，200062)

由于人类的乱捕滥猎和环境的不断恶化，许多动物濒临灭绝境地，人们迫切要求了解这些动物的生存状况，从而采取适当的保护和管理措施。近年来，濒危野生动物的保护主要集中在遗传多样性方面的保护，微卫星技术正是遗传多样性研究的重要手段之一。随着微卫星等分子生物学技术的发展，研究者可以通过一些分子标记来研究种群的扩散模式，从而可以更加有效地保护和管理野生动物[1]。

1 粪便分子生物学

1.1 粪便分子生物学在濒危物种保护中的应用

粪便分子生物学技术就是从动物粪便中提取动物基因组DNA，然后借助PCR技术和多种分子标记，从而对动物进行遗传分析的研究[2]。濒危野生动物的保护目前主要集中在遗传多样性方面的保护。而要获取动物的遗传信息，必须采集含有遗传物质的样品进行分析。在20世纪六七十年代，通常采用损伤性取样法，如杀死研究对象以获得新鲜样品，由于这种取样方法常常对动物资源造成极大破坏，其应用范围受到很大限制。以粪便学为基础的粪便取样分析方法，在很大程度上解决了这一问题。而且粪便的采集要比血液和组织的采集更容易、更方便，一般不会对濒危动物的身体和生活造成任何不利影响，这对濒危动物的保护有十分重要的实际意义。

1.2 粪便作为分子生物学研究材料的可行性

粪便的主要成分是未消化的食物残渣，这些食物残渣在通过肠道时经常会夹杂有大量的脱落的肠道上皮细胞。据研究报道，每个人每克新鲜粪便中就含有100 000个肠道上皮细胞[3]，而且大部分是活细胞，这就意味着研究者可以从粪便中获取粪便产生者的DNA进行遗传分析，也就是说它具备核DNA的所有标记，例如RFLP、RAPD和AFLP，以及微卫星标记等，这对于濒危野生动物的遗传学研究有非常重要的意义；另外，在野外自然条件下采集的新鲜粪便在酒精中保存半年以后仍能成功地提取出DNA，而且发现在干燥或冷冻的条件下也能很好地保存粪便样品[4]，这说明野生濒危动物的粪便采样及保存是十分可行的。相关的实验已有报道，如Reed等利用微卫星技术对82个海豹(Phocidae)粪便样品成功地进行了个体识别和种群大小的估计，同时他们还利用性染色体上的SRY-Y53-3C，SRY-Y53-3D引物对海豹粪便DNA进行扩增，结果从40个海豹粪便样品检测到1例雄性个体[5]。在国内方盛国等通过对大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)的粪便DNA的提取，同时借助限制性酶切、分子杂交、同位素标记等技术成功地构建了大熊猫指纹图谱[6-7]。由此可见，粪便分子生物学方法正在成为野生动物遗传学分析的重要工具。

2 微卫星DNA

微卫星DNA也被称为数目可变的串联重复、短串联重复、简单序列重复和简单序列长度多态，是指以1—6个核苷酸为基本重复单位的串联重复序列[8]。它们广泛存在于各类真核生物基因组中，原核生物基因组中也含有少量的微卫星序列。微卫星序列具有种类多、分布广泛、高度多态性、杂合性高、重组率低的特点，在群体中变易范围大，构成了丰富的长度多态性，有高度的个体特异性，并遵循孟德尔共显性遗传规律，是近年来飞速发展起来的一类新型的DNA高度多态性遗传标记系统。目前，微卫星技术已广泛应用于高分辨率的遗传连锁图谱的构建，对人类疾病的诊断和鉴别、群体遗传研究、法医上的人身鉴定以及亲属血缘关系鉴定等[9]。

2.1 微卫星DNA位点的获得

为了从微卫星DNA中得到有效的生物学信息，微卫星DNA位点的获得是微卫星分析的关键。目前获得微卫星位点的途径主要有两种：一是基于微卫星DNA文库克隆所需要的微卫星位点。这种方法包括构建DNA文库、筛选克隆片段、测序和根据序列设计PCR的引物以进行微卫星位点的扩增。这种方法可以一次性获得成百上千个微卫星位点，其缺点是操作烦琐，工作量大，且耗资巨大。二是利用已发现的微卫星位点寻找新的位点。Moore等发现了哺乳动物基因组中的保守微卫星位点[10]。Engel等发现，为某一种偶蹄目(Artiodactyla)动物设计的引物，也可以扩增出其他偶蹄目动物的微卫星。例如，他们用牛、山羊和绵羊的微卫星位点设计的PCR产物，从旋角羚(Addaxnasomuculatus)等16种牛科(Bovidae)动物的345个组织冻存样中，成功扩增了微卫星多态产物。其他一些研究也证实，对于同属、科、目中的不同物种也可以使用异种引物扩增微卫星，从而大大推动了微卫星分析的应用[11]。

2.2 微卫星的应用

2.2.1 个体识别

个体识别需要大量的分子标记，其中微卫星标记是目前应用的最为广泛的，因为微卫星符合孟德尔遗传，而且在个体间呈现出较高的多态性，因此常用来进行个体识别。

2.2.2 性别鉴定

濒危动物性别的鉴定也是估计该濒危动物生存力的一个重要指标。如果雌雄性比严重失衡，终将影响该濒危动物的繁殖力，抑或造成严重的近交衰退，继而影响其种群的生存力。Wasser等利用粪便中提取的DNA，通过引物ZFY/X-P1-5EZ，ZFY/X-P1-3EZ，SRY-Y53-3C，SRY-Y53-3D等4对引物成功地鉴定出2只马来熊(Helarctosmalayanus)的性别为一雌一雄[4]。

2.2.3 亲子鉴定

亲子鉴定所采用的分子标记种类繁多，如同工酶、AFLP、DNA指纹、微卫星等[12]。其中，微卫星标记则因其共显性、高度多态性、模板量要求低和应用方便等优势，成为了相关领域首选[13]。而亲子鉴定所采用的数理方法则主要有3种[14]：排除法、似然法和基因型重建法。其中排除法根据孟德尔遗传定律检测母亲与可疑父本基因型组合能否产生子代基因型，若不能则排除相应可疑父本。似然法则是根据等位基因频率计算各非排除父本为亲生父本的概率从而确定最大可能父本。而基因型重建较多用于多父本现象存在的物种的种群结构分析中[15]。张于光对东北虎(Pantheratigrisaltaica)微卫星DNA遗传标记引物进行了筛选，并利用筛选出的引物成功地对7对父子关系不明的东北虎进行了鉴定，为东北虎后代繁殖措施的制定提供了有利的依据[16]。张亚平等用微卫星DNA进行圈养大熊猫的亲子鉴定，发现在一雌多雄交配过程中，只有个别雄性个体是有效的。该研究还结合基因型的鉴定，制定了繁殖计划，防止圈养大熊猫出现近交衰退现象[17]。

2.2.4 家域分析

家域(home range)是动物进行取食、交配、育幼等日常活动的区域，对于动物的生存和繁衍、保育和再引种具有重要意义[18-20]。国内外大多数学者关于有蹄类家域的估算方法多采用最小凸多边形法(minimum convex polygon，MCP)和内核法(kernel)，基于微卫星技术用于物种家域的研究相对较少。Taberlet等通过遗传学方法获得的比利牛斯山脉棕熊(Ursusarctospyrenaicus)的家域数据与欧洲和北美洲利用无线电跟踪技术研究的结果一致[21]。Kohn等描述了家域的使用、父权鉴定和亲缘关系鉴定都能用粪便基因型的分布和关系模式来推断[22]。Smith等应用遗传学和GIS两种方法评价了胡安捷狐(Vulpesmacrotismutica)粪便微卫星DNA结果可靠度的可行性和应用性[23]。

3 扩散生态学研究

扩散是指个体离开现有的种群或父母种群的行为[24]。扩散所带来的后果不仅作用于个体适合度，而且影响种群动态，种群遗传多样性和物种分布[25-26]。大量的研究把扩散分为出生扩散(natal dispersal)和繁殖扩散(breeding dispersal)[27]。出生扩散即个体在出生地或社群到繁殖地或繁殖社群之间的永久移动，不管扩散出去的个体繁殖与否；繁殖扩散指繁殖个体在两个连续的繁殖群和繁殖社群间移动。扩散会影响种群密度[28]；调节种群内个体对资源和配偶的竞争压力；减小种群内个体间近亲繁殖的机会，避免近交衰退[29]；影响社群结构和婚配系统[30]；还影响着种群的基因流动，进而影响种群的种群结构和遗传多样性[31-32]。

3.1 研究内容及方法

早期人们使用环志和无线电遥测研究鸟类或兽类的迁移扩散行为。但这些方法的共同弊端在于要捕获动物。有些动物难于捕获，捕获后的重捕率低，这些都对扩散的研究产生不利的影响。而且捕获和标记易对动物造成损伤，甚至导致动物死亡。近年来，随着粪便分子生物学在生态学研究中的广泛运用，非损伤性取样也成为研究扩散模式的主要方式[33-34]。分子生物学方法的优点不仅在于它能够获得大量样本，以弥补直接方法在样本量上的不足；更重要的是它能够探讨历史上的扩散活动对当代种群遗传结构的影响[35-36]。随着分子生物学技术的发展，研究者可以通过同工酶、线粒体DNA、随机扩增多态性DNA(RAPD)、小卫星DNA、微卫星DNA技术等一些分子标记来研究种群的扩散模式，从而在更大时间尺度上研究物种的扩散[37-38]。分子生物学方法通过比较种群内被捕获个体和其他个体的遗传相似度，并结合标记重捕的数据对被捕获个体是否从其他地方迁入做出推测，继而研究扩散模式[36，39-40]。

3.2 偏性扩散

在主动扩散的鸟类和兽类中，扩散往往存在着性别偏倚，即偏性扩散[41]。了解为什么会发生偏性扩散仍然是进化生态学关心的重点。在哺乳动物中有偏雄性扩散的趋势，而在鸟类中偏雌扩散占大多数。也有很多反例存在，比如大熊猫[34]、某些灵长类[33]中则为偏雌扩散。在野外精确测量偏性扩散仍然是一个问题，所以很多分子方面的技术及参数就被用来研究某个物种是否存在着偏性扩散，如Goudet等利用共显性遗传标记检测偏性扩散[42]。

种群内个体间相互作用、近亲繁殖的避免、配偶和资源竞争、空间异质性都是引导扩散进化的动力。栖息地的异质性、有限的资源和条件决定的扩散都表明同种个体间、同性成员间，亲缘间的竞争在扩散的进化中充当着重要的角色[27]。不同的栖息地质量和社会结构能使空间异质性降低，栖息地的质量不仅体现在资源水平方面，还体现在竞争者的密度、寄生虫和捕食者。在很多物种中，寄生虫和捕食者的密度与扩散相关。

4 结语

目前微卫星技术在野生动物的保护与管理中应用的越来越多，也得到了一些传统方法无法得到的研究成果，对于野生动物的遗传结构分析、谱系图谱构建、系统分类等都起到了重要的作用，也对一些濒危物种的迁徙扩散行为进行了一定的研究，但目前国内微卫星等分子生物学手段在珍稀濒危动物的迁徙扩散研究还不是很多，今后若加强这方面的研究，必将对珍稀濒危动物的保护与管理提供更加可靠的参考依据。