含胱天蛋白酶富集功能域凋亡抑制因子在心血管疾病中的研究进展

李 奇，杨 俊，杨 简，杨 英

三峡大学第一临床医学院心内科 心血管病研究所，湖北宜昌 443002

随着生活水平的不断提高，国民不健康生活方式越来越多，我国居民心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)患病率以及死亡率仍处于上升阶段且居高不下，早已超过肿瘤和其他疾病成为威胁人类健康的“头号杀手”[1]。细胞凋亡是由多种基因控制的程序性死亡，其中凋亡引起的心肌细胞死亡能导致多种CVD如心肌病、心肌肥厚、心力衰竭的发生，是CVD发生发展过程中不可缺少的环节之一。因此，寻找心脏特异性表达的抗凋亡蛋白如含胱天蛋白酶富集功能域凋亡抑制因子(apoptosis repressor with caspase recruitment domain，ARC)已成为防治CVD研究的热门领域。

ARC的结构与特点

ARC作为心脏中唯一一种高表达的抗凋亡蛋白，最早发现于大鼠的嗜铬细胞瘤与脑组织的cDNA文库中，通过对其结构与功能的分析发现，此蛋白带有胱天蛋白酶富集功能域(caspase recruitment domain，CARD)并与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-2、Caspase-9以及凋亡蛋白酶激活因子-1的CARD结构域高度同源，因此ARC与凋亡具有密切联系[2]。来源于人的ARC cDNA编码的蛋白质含208个氨基酸，相对分子质量为2260，并与大、小鼠源ARC蛋白有很高的同源性，而且人类与小鼠以及大鼠的ARC蛋白均含有两个不同的结构域，分别为N端CARD结构域和C端富含脯氨酸与谷氨酸残基的结构域[3]。此外，人源性ARC蛋白具有两个转录子，分别编码ARC蛋白与一种相对分子质量为3000的相关的核仁蛋白，然而关于其核仁蛋白的作用目前尚无定论。生理情况下，ARC主要分布在骨骼肌、心肌和大脑等终末分化组织中，且在胞质与胞核中均有表达，而胞质中的ARC可以与死亡受体结合以及抑制线粒体凋亡途径发挥抗凋亡作用[4]。由此合理推测ARC蛋白可通过其抗凋亡作用来抑制心肌细胞凋亡，从而改善心脏功能。除了在终末分化组织中表达之外，ARC也被发现存在于乳腺、结肠、子宫颈等癌细胞系中[5-6]。早期研究显示，在乳腺浸润性癌变组织中ARC阳性表达率明显高于正常乳腺组织，提示ARC与癌细胞的发生发展关系密切[7]。

ARC的抗凋亡作用

细胞凋亡作为生命的基本现象，不仅在维持内环境稳定和组织器官发育中发挥至关重要的作用，还参与多种疾病的病理生理过程。如前所述，ARC主要通过两条经典途径发挥抗凋亡作用。一条由死亡受体介导的外源性途径，即ARC的CARD结构域能够直接与Fas以及带有死亡结构域的Fas相关蛋白(Fas-associating protein with a death domain，FADD)的死亡结构域竞争性结合，阻断Fas和FADD之间相互作用，导致死亡诱导信号复合体的组装无法顺利完成，从而抑制外源性凋亡途径，同时ARC的CARD结构域也可以直接与Caspase-8结合抑制其活化，进而阻断Caspase-8介导的凋亡反应[2，8]。另一条则是由线粒体介导的内源性途径，在胞质内ARC的CARD结构域直接与促凋亡蛋白Bax的C端结合，抑制Bax从胞浆内进入线粒体，降低电势差和膜通透性的变化从而导致细胞色素c的释放减少，从而阻断内源性凋亡途径，同时ARC的CARD结构域还可以直接与p53上调凋亡调控因子以及Bad结合从而释放抗凋亡因子Bcl-2发挥其内源性抗凋亡作用[8-10]。因此，ARC是目前少数已知的具有抗外源性以及内源性凋亡生物学功能的分子蛋白，其抗凋亡功能依赖其特殊的蛋白结构功能域。此外，研究显示在H9C2心肌细胞中ARC可维持细胞内K+浓度平衡从而保持细胞体积正常，其可通过阻断K+通道，抑制K+外流引起的细胞皱缩以及心肌细胞凋亡[11]。

另一方面，研究表明只有当ARC磷酸化后才能发挥抗凋亡作用，同时磷酸化的ARC也可以经去磷酸化作用而丧失其活性[12]。Tan等[13]研究证实，醛固酮与异丙肾上腺素刺激引起的凋亡，并没有降低ARC的表达水平，但却通过去磷酸化作用抑制了ARC的抗凋亡能力。此外，ARC还受到泛素-蛋白酶体介导的降解作用，通过泛素E3连接酶小鼠双微体2(murine double minute 2，MDM2)与ARC相结合从而导致ARC的表达降低，因此MDM2可能是ARC蛋白表达的重要调节因子，而当ARC泛素化位点突变时也可抑制凋亡刺激物诱导的ARC表达降低，从而发挥其抗凋亡作用[14]。

ARC在心血管疾病中的作用及机制

由于ARC蛋白强大的抗凋亡作用，其在心脏生理功能维持方面起着重要的保护效应，心脏一旦受到刺激如心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/ reperfusion injury，MI/RI)、心肌损伤、心脏瓣膜功能障碍，ARC便能够介导抗凋亡作用改善心脏功能。病理条件下，ARC表达下调也可能导致多种心脏疾病的发生，如心肌肥厚、心力衰竭(heart failure，HF)和心肌梗死等[15-17]。

ARC与MI/RI 凋亡反应作为MI/RI发病机制中的关键环节之一，在MI/RI的发生发展过程中发挥重要作用。Pyo等[18]采用结扎冠状动脉左前降支建立MI/RI模型，结果发现与野生型小鼠相比，特异性表达ARC的转基因小鼠(TgARC)心肌梗死面积显著减少，心肌损伤得到明显改善。Donath等[19]对ARC基因敲除小鼠进行I/R处理发现，与对照组相比，ARC敲除小鼠心肌梗死面积显著增加，其心肌凋亡细胞量也提高了近2.5倍。以上结果表明ARC蛋白的表达能够有效改善MI/RI。在MI/RI的离体实验中，Yao等[12]通过H9C2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)模型发现，ARC蛋白表达量并没有发生明显变化，但却显著降低了ARC磷酸化表达，同时伴有线粒体中细胞色素C的释放和Caspase-3的激活，而当ARC表达上调并发生磷酸化后可以明显减少由H/R诱导的H9C2细胞凋亡，其机制与ARC能够调控Fas、Cyt-c以及Caspase-3等相关凋亡因子的表达有关，且只有当ARC磷酸化后才能发挥其抗凋亡作用。此外，该研究组还发现，硫氢化钠作为硫化氢的供体和原料可以增强ARC磷酸化抑制MI/RI诱导的心肌细胞凋亡从而改善MI/RI，进一步证实ARC的抗凋亡活性可能依赖于其磷酸化状态[12]。新近研究显示，小剂量的醛固酮受体拮抗剂如螺内酯或依普利酮可以有效抑制Caspases-2、3、9的激活从而减轻MI/RI，其主要作用机制是醛固酮可通过泛素-蛋白酶体途径导致ARC的降解，而螺内酯或依普利酮可减少ARC的降解进而抑制心肌细胞凋亡[20]。以上结果表明ARC可能是临床防治MI/RI有效的药物干预靶点。另一方面，Xu等[21]最新研究显示在MI/RI发生过程中，ARC还可以通过抑制线粒体膜通透性转换孔的开放调控心肌程序性坏死，减少心肌梗死面积，这证实ARC可能在心肌坏死过程中存在一定作用。

ARC与心肌肥厚 尽管凋亡与细胞肥大是不同的两种途径，但两者存在着共同的刺激因子如血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-，TNF-)，而且细胞凋亡还可以诱导心肌代偿性肥大持续恶化发展为心力衰竭[17]，所以，ARC蛋白在心肌肥厚中的作用是不可忽视的。Murtaza等[22]通过Ang Ⅱ、TNF-、苯肾上腺素刺激诱导小鼠心肌肥大显示，ARC磷酸化水平以及酪蛋白激酶2(casein kinase 2，CK2)活性明显降低，而上述刺激效果又能被ARC过表达所抑制，因此ARC过表达可能抑制心肌肥厚的发展，同时敲除内源性的ARC抑制其表达或阻止其磷酸化又可以诱导心肌肥厚的发生。其中CK2是ARC的上游调控因子，能够促使ARC蛋白上的149位苏氨酸发生磷酸化，从而发挥抗心肌肥厚作用。进一步研究显示，ARC在预防内皮素-1诱导的心肌肥厚中具有潜在的干预作用，且ARC对心肌肥厚的改善依赖于其对活性氧的清除，并证实CK2介导ARC磷酸化进而协同对抗心肌肥厚[23]。万帝等[24]通过腹主动脉缩窄法建立高血压诱导大鼠心肌肥厚模型同样发现ARC是改善心肌肥厚与凋亡的关键调控蛋白质，通过提高ARC磷酸化修饰水平可强化其功能状态，有效抑制高血压所致的心肌细胞肥大相关信号通路的激活。此外，赵婧[25]采用胰岛素诱导建立肉鸡心肌细胞肥大模型，结果提示ARC蛋白可以通过其C末端与Ca2+结合，阻断由ATP刺激引起的Ca2+浓度升高，较低浓度的Ca2+抑制原癌基因c-myc的表达，从而在一定程度上抑制心肌细胞的肥大和凋亡。因此，ARC具有抑制心肌肥厚的作用，其机制可能与其磷酸化水平以及心肌细胞中原癌基因的抑制有关。

ARC与心力衰竭 有研究显示，HF终末期的患者心肌组织中ARC蛋白表达较心功能正常心肌组织减少了36.7%[19]。由此推断，HF的发生发展可能与ARC的表达有关。Li等[26]通过小鼠横主动脉缩窄建立HF模型，经腺病毒转染诱导ARC过表达后发现，ARC表达上调可以降低Caspase家族相关因子的活性从而抑制外源性与内源性凋亡途径，最终在HF的发展过程中提供心肌保护作用。但ARC的抗凋亡作用可被HF的介体分拣连接蛋白13(sorting nexin-13，SNX13)调控，SNX13的N-端PXA结构域可以介导ARC在胞内的运输，有效防止ARC被溶酶体降解，因此，SNX13可以促进ARC的稳定从而抵抗HF的发展。为进一步证实ARC在心肌组织中抗HF作用及机制，Wang等[17]研究发现心脏特异性表达TgARC小鼠在HF模型中同样具有心肌保护作用，而微小RNA(microRNA，miRNA)-223作为HF的正调控因子可通过抑制其下游靶点ARC表达诱导HF进一步恶化。值得一提的是，一种新发现的一类非编码RNA—环状RNA(circular RNA，circRNA)可以作为miRNA海绵与miR-223相互作用从而导致ARC的表达增加，以上结果提示ARC与miR-223以及circRNA可以组成一条新的调节途径，为HF的治疗提供有吸引力的靶点。

ARC与其他心脏性疾病 急性病毒性心肌炎(acute viral myocarditis，AVMC)发展过程中，心肌细胞可呈凋亡样改变并显著增加，提示心肌细胞凋亡同样参与了AVMC的病理生理过程[16]。汤道文等[27]通过注射柯萨奇病毒B3建立小鼠AVMC模型，7 d后ARC错义寡核苷酸组的ARC表达水平明显高于对照组，而其心肌损伤程度远远小于对照组，表明在AVMC小鼠中高表达的ARC可以抑制心肌细胞凋亡，保护心肌组织免受凋亡因子带来的损伤，其机制可能与抑制动力相关蛋白介导的Caspase相关因子活化以及线粒体分裂有关。最新研究还显示，细胞凋亡与心脏瓣膜疾病的预后存在密切联系，Jan等[28]通过收集接受瓣膜置换手术患者的瓣膜组织并将术后切除的瓣膜分成两部分，一部分包含受损结节，另一部分由周围组织组成作为对照，结果提示ARC的表达在所有主动脉瓣以及二尖瓣功能障碍(反流与狭窄)的病理状态下均显著减少，并证实ARC可能受到其上游因子如miR-214的调节，但其具体作用及机制仍待深入研究。

总结与展望

综上，ARC是介导CVD发生发展及转归过程中重要的调控因子，并可通过其抗凋亡效应发挥心肌保护作用。最近研究显示，通过调控ARC介导的凋亡途径可以减轻由阿霉素诱导的心脏毒性，这对于克服化疗治疗癌症产生的心脏毒性提供新的治疗手段和理论依据[29]。因此，进一步深入研究ARC在CVD中的作用刻不容缓，是否存在其他上游靶点如miRNA可以调控ARC的表达[30]，其不同的上游靶点之间是否存在相互协同或拮抗作用？ARC抑制线粒体膜电位去极化是否会影响其能量代谢作用？随着ARC及其上游调控靶点在各种CVD中调控机制的不断明确，ARC的抗凋亡作用将成为心脏疾病治疗的有效靶点，为临床上疾病的预防及治疗奠定理论基础。