昆虫发生菊酯抗性细胞色素P450s研究进展

龙再浩 马思杰 罗 洁

（宁波国际旅行卫生保健中心 浙江宁波 315012）

1 前言

药物杀虫剂（包括菊酯）长期使用会诱导昆虫出现抗性。抗性产生是昆虫适应环境并不断进化的结果，抗性产生涉及复杂机制，如细胞色素P450s、钠离子通道等。本文主要就细胞色素P450s在病媒昆虫（蚊、蜚蠊和蝇）菊酯抗性机制研究进展进行综述。

2 昆虫P450s功能

细胞色素P450s组成自然界最大的超基因家族，发挥广泛生理功能。昆虫体内发现超过300种P450s，分布于70种已知P450超基因家族中27个CYP家族。比如，在黑腹果蝇基因组鉴别出90个P450基因，属于25个家族；冈比亚按蚊基因组鉴别出111个P450基因。昆虫体内P450s分布呈现出发育和特异性组织表达的多样性。有些P450s出现在生命所有阶段，如CYP4D1、CYP6A；有些显著年龄特异性表，如 CYP6B1、CYP6B2、CYP6B3、CYP6D1 和 CYP6L1，还有某些P450s仅在某些组织中能表达[1]。

昆虫体内细胞色素P450s最主要的功能是解毒/激活化合物。它是内源性化合物（信息素、蜕皮激素、保幼激素等）生物合成和降解通路的重要组成部分，可调节昆虫生长、发育和繁殖；也是外源性化合物最主要代谢酶，包括药物、杀虫剂、植物毒素、化学致癌物和突变物等。昆虫代谢或解毒有毒物质能力的差异，也就产生了抗性。抗性对于昆虫生存，尤其是在化合物不利的环境下至关重要。研究认为，昆虫抗性产生是复杂的，涉及多种作用机制，包括电压门控钠离子通道、P450代谢酶、有机磷代谢酶、谷胱甘肽-s-转移酶等。过去研究发现抗性昆虫体内存在多个P450s基因过表达或诱导表达情况，证实P450s是昆虫产生包括菊酯类杀虫剂抗性的原因[2，3]。应用转录组学等技术证实P450s在多种抗性昆虫作用，包括蚊、蝇和蜚蠊等。

3 P450s菊酯抗性基因

3.1 P450s基因在菊酯抗性证据

研究已证实P450s是昆虫产生菊酯抗性主要原因之一，有些情况可能是决定因素。研究应用协同剂PBO（细胞色素P450单胺氧化酶抑制剂）、DEF（水解酶抑制剂）和DEM（GST酶抑制剂），比较有无协同剂条件下昆虫对氯菊酯抗性变化。结果显示，PBO能显著降低家蝇、蚊虫和德国小蠊对氯菊酯的抗性系数，证实P450s解毒作用是昆虫菊酯抗性产生的主要机制[4]。Hardstone等[5]通过回交方法把菊酯抗性淡色库蚊与敏感品系交配产生新品系蚊虫，该品系在遗传基础上将kdr（击倒抗性）分离，保留P450抗性，结果新品系抗性系数仍高达1 600倍。该研究揭示P450机制是该品系蚊虫产生氯菊酯抗性最主要原因。Estep等[6]报道菊酯抗性埃及伊蚊中存在P450过表达和钠离子通道突变等，应用PBO证实P450s解毒作用约占抗性产生一半原因。进一步研究发现抗性昆虫体内有一个以上P450s基因过表达/诱导增加情况，有时还有表达减少情况，揭示多个P450s基因相互作用是昆虫抗性产生原因之一。Yang等[7]应用全基因组测序方法比较研究致倦库蚊氯菊酯抗性群和敏感群体内204个P450基因表达谱差异，结果发现幼虫有11个基因上调和5个下调，成虫有7个基因上调和4个下调，其中，CYP6AA7和CYP4C52V1上调，CYP6BY3下调，证实蚊虫抗性产生是多个P450基因共同作用结果。Li等[8]对多杀虫剂抗性家蝇的全转录组进行分析，证实了多个P450s基因上调是家蝇产生高水平抗性的原因。

3.2 CYP4抗性基因

CYP4家族在细胞色素P450s基因中的数量最多，有多个基因被证实与菊酯抗性有关。Muller等[9]研究报道冈比亚按蚊氯菊酯筛选群与初始群比较，CYP4H19和CYP4H24是轻度过表达（＜2倍）。研究显示，在昆虫发育不同阶段中P450s抗性基因表达是有差异。Pridgeon等[10]比较研究氯菊酯和溴氰菊酯抗性和敏感德国小蠊CYP4G19表达水平，虫卵表达水平无差异，幼虫期有1.7倍差异，成年期表达水平有5倍差异。Shen等[11]报道了溴氰菊酯抗性成年淡色库蚊 CYP4H21、CYP4H22、CYP4H23、CYP4J4 和 CYP4J6是过表达。研究还发现这些基因在幼虫时没有上调。Komagata等[12]报道研究中菊酯抗性致倦库蚊有多个P450s抗性基因，其中，包括CYP4基因过表达CYP4D40、CYP4H34（8.3倍），同时过表达基因还有CYP9M10（264 倍）、CYP6Z10（3.9 倍）和 CYP6M12。

3.3 CYP6抗性基因

目前已在多种抗性昆虫体内发现CYP6基因族多个基因与昆虫菊酯抗性相关，如CYP6A1(抗性家蝇）、CYP6A2（抗性果蝇）、CYP6D1（抗性家蝇）和CYP6F1（抗性致倦库蚊）。Scott等[13]报道菊酯抗性家蝇体内除了钠离子通道突变位点外，还发现CYP6D1过表达。Pan等[14]对菊酯抗性家蝇体内过表达CYP6D1基因进一步研究时发现了一个新的CYP6D1等位基因（CYP6D1v1）。 Ishak等[15]应用微阵列转录组技术发现白蚊伊蚊产生菊酯抗性与CYP6P12过表达和降低表皮穿透能力有关，而且表达CYP6P12转基因果蝇获得菊酯抗性进一步证实CYP6P12抗性作用；缺乏kdr突变菊酯抗性昆虫CYP6P12过表达。Mao-Qing Gong等[16]研究报告在菊酯抗性淡色库蚊中有CYP6F1过表达，Kasai等[17]报道在氯菊酯抗性致倦库蚊的幼虫发现CYP6F1转录增强，Komagata等[18]对同品系菊酯抗性致倦库蚊种群中没有发现CYP6F1表达增加，提示CYP6F1是否参与抗性还不明确。Dusfour等[19]研究报告在溴氰菊酯抗性埃及伊蚊发现多个P450基因上调表达，有CYP6BB2、CYP6M11、CYP6N12、CYP9J9、CYP9J10 和 CCE3，还发现电压依赖钠离子通道突变位点I1016和C1534。在菊酯抗性冈比亚按蚊体内发现CYP6Z亚家族中3个P450s基因（CYP6Z1、CYP6Z2 和 CYP6Z3）显著过表达，但是没有证实具有代谢菊酯能力[20，21]。从南部贝宁和尼日利亚地区多种菊酯抗性冈比亚按蚊体内发现CYP6P3和CYP6M2显著增高[22-24]。

3.4 CYP9抗性基因

CYP9基因族中也发现CYP9A12、CYP9M10等基因与昆虫的菊酯抗性密切相关。Strode等[25]开展针对菊酯抗性埃及伊蚊CYP9基因组学表达研究发现37个基因中至少有13个是过表达。Yang等[26]研究发现氰戊菊酯抗性品系棉铃虫蛾体内P450基因中 CYP9A12（433 倍）和 CYP9A14（59 倍）是高度过表达。Ishak等[27]研究报道应用基因组微阵列转录组技术分析检测菊酯抗性埃及伊蚊基因表达图谱，总共发现有204个基因过表达，包括谷胱甘肽-s-转移酶、胆碱酯酶等，其中，过表达P450s基因有CYP9J27、CYP6CB1、CYP9J26 和 CYP9M4，CYP9J27 表现出高度基因多态性。Komagata等的研究发现菊酯抗性致倦库蚊JPal-per品系幼虫期抗性水平非常高，是敏感群的29 000倍，成年期抗性相对较低。研究发现该品系蚊子体内CYP9M10和CYP4H34表达水平在幼虫阶段都是最高，在蛹和成年期表达水平就急剧降低，其中，Jpal-per种群体内CYP9M10表达水平是敏感组过表达水平264倍。Gong等[28]还发现CYP9M10和CYP6AA7导致氯菊酯抗性与细胞色素P450还原酶（CPR）相关，应用CYP9M10或CYP6AA7与CPR共表达Sf9细胞，检测发现细胞对氯菊酯及其代谢物代谢能力增强，从而提高细胞对氯菊酯的耐受性。

4 P450s抗性调节机制

4.1 GPCR/Gαs/ACs/cAMP/PKA调节

既往研究已证实，多个P450s抗性基因共同相互作用参与了昆虫菊酯抗性的形成，影响昆虫P450s抗性基因的表达。研究报道昆虫P450s抗性基因调节是通过顺式/反式作用元件的方式，G蛋白偶联受体（GPCR）/Gαs（Gsα 亚单位蛋白）/ACs（腺苷酸环化酶）/cAMP/PKA（蛋白激酶A）信号传导通路在P450s抗性基因调节起重要作用。Li等[29]报道视紫红质G蛋白偶联受体参与P450s抗性基因表达调节。在抗性致倦库蚊中敲低视紫红质样GPCR基因会降低对氯菊酯抗性，同时会减少2种CAMP依赖蛋白激酶和4种P450抗性基因表达。视紫红质转基因果蝇具有氯菊酯抗性和P450抗性基因表达增加。GPCR信号传导系统第二信使cAMP和下游效应器PKA也参与了P450s抗性基因调节。抑制cAMP产生会显著降低4种p450抗性基因（CYP9 M10、CYP6AA7、CYP9J34和CYP9J40）和2种PKA基因的表达，降低蚊虫对氯菊酯的抗性。敲低PKA基因对蚊虫氯菊酯抗性和P450基因表达会产生同样效果。GPCR/cAMP/PKA调节通路负责P450基因表达和P450调节抗性在致倦库蚊。进一步研究证实GPCR信号传导通路的Gαs等成分也参与P450s抗性基因调节。Li等应用RNAi和基因敲低技术研究氯菊酯抗性致倦库蚊体内G蛋白偶联受体细胞内信号传导成分Gαs、ACs在P450s调节菊酯抗性机制作用。研究发现，敲低Gαs能引起下游效应器ACs、PKA和抗性P450基因表达水平，同样敲低ACs也会减少PKA和P450s抗性基因表达。研究也发现无论敲低Gαs或ACs都会增强蚊虫对氯菊酯的敏感性。时间和空间动力学分析表明Gαs、ACs and PKAs主要高度表达在脑部。P450s抗性基因主要表达在脑、中肠和马氏管，表明其在中枢神经系统中发挥作用[30]。

4.2 piRNAs和MicroRNAs

piRNAs是一类新的非编码单链RNA，具有生殖细胞维持、脑发育、表观遗传调节癌症和抗病毒功能。研究显示piRNAs通过与CpCYP307B1结合实现调节P450s抗性基因表达。Ye等[31]研究发现piRNA-3878与淡色库蚊菊酯抗性相关，溴氰菊酯抗性淡色库蚊体内表达水平低。过表达piRNA-3878能增强抗性品系敏感性，抑制表达则增加抗性。CpCYP307B1是piRNA-3878靶点，下调CYP307B1表达能增加蚊虫死亡率。

miRNAs是在转录后基因表达调控发挥作用，研究显示它也参与P450s抗性基因表达调控。Tian等[32]研究发现溴氰菊酯抗性品系淡色库蚊种MiR-285显著上调，微注射miR-285增加蚊子对溴氰菊酯处理的生存率。CYP6N23是MiR-285靶点，溴氰菊酯抗性品系中发现CYP6N23低表达，通过RNAi干扰技术微注射针对CYP6N23或MiR-285类似物，在下调CYP6N23表达同时降低蚊子死亡率。

4.3 CYP9M10

目前对CYP9M10抗性基因调控方式研究较为透彻。CYP9M10通过CuRE1调节昆虫菊酯抗性，并且高表达CYP9M10单体型（强菊酯抗性）还与基因重复和顺式作用突变相关。Itokawa等[33]研究蚊虫过表达CYP9M10mRNA单体型中发现在转录起始位点（TSS）上游0.2kb区域插入一个转座元件CuRE1，并且含有CuRE1插入比没有插入CYP9M10表达水平高。对CYP9M10深入研究发现表达水平最高CYP9M10单体型（即抗性最高）基因组包含100 kb大小串连重复序列，其包含CYP9M10基因座，表达水平是不含重复序列的7.6倍[34]。出现重复序列被认为与位于CYP9M10启动子核心区域发生的单核苷酸置换有关，Iotkawa等[35]应用荧光素酶报告基因技术发现，核苷酸（G-27A）突变增加2倍表达水平；相反，删除包含该位置核苷酸的7 bp AT富裕序列，会抑制转录启动。

5 结语

昆虫抗性是昆虫适应杀虫剂环境而出现的一种复杂进化机制，P450s作用机制只是其中一部分。深入研究和理解昆虫抗性发生分子机制，对发现有效抗性分子标志物和研制新型有效杀虫剂、改善有害昆虫的综合措施具有积极的指导意义。