针刺调控NRG/ErbB通路对脑梗死后的神经保护作用研究进展*

王东岩，麻聪聪,董 旭，杨海永

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

中国卒中发病率是全世界最高的国家之一，在脑卒中患者中高达67.3%～80.5%的脑卒中病例归因于缺血性脑卒中(脑梗死)。针刺治疗脑梗死的疗效越来越得到认可，对其治疗机制的探讨也成为近年来的研究热点。神经调节蛋白(Neuregulin,NRG)是一类复杂的因子，在神经发育过程中起着许多作用。实验表明，神经调节蛋白促进神经元的迁移和分化，并调节神经元和神经肌肉接头处神经递质受体的选择性表达,还调节神经胶质细胞的增殖、存活和分化。在神经元间的突触，NRG及其ErbB受体在突触后与PDZ结构域蛋白结合，从而可以调节突触可塑性。研究表明，针刺能够调控内源性NRG/ErbB信号通路，起到神经保护作用和促进脑梗死恢复。

1 脑梗死后NRG及其受体ErbB的上调

1.1 脑梗死后NRG的上调

在正常大鼠大脑中，NRG的免疫反应性存在于大脑皮质、海马和尾壳核[1-2]。Parker等[3]用大鼠永久性大脑中动脉阻塞模型(MCAO)来检测神经调节素在缺血性卒中发病后的分布。MCAO后，梗死半球半影的NRG免疫染色与对侧半球相比显著增加，梗死核心周围皮质的染色显著高于对侧大脑半球的相应区域，梗死核心区有少量或无特异性染色。Erlich和Gerecke等[2,4]使用MAP-2(神经元细胞体和近端树突特异的标记)来检测NRG的神经元表达，发现半影区NRG的增加主要与神经元有关。在创伤性脑损伤模型中，星形胶质细胞和小胶质细胞中NRG和ErbB受体的表达增加，通常不表达神经调节蛋白。因此，研究NRG在星形胶质细胞和巨噬细胞/小胶质细胞中的表达，结果显示在高倍率下检查GFAP阳性区域与NRG没有任何显著的共定位。因此，在缺血发作后72 h，胶质外维酸性蛋白(GFAP)阳性星形胶质细胞中没有诱导NRG。使用ED-1抗体发现，与同侧半球相关的巨噬细胞/小胶质细胞数目显著增加，而对侧半球很少见到。ED-1阳性细胞分布于梗死中心，与NRG无共同标记；ED-1阳性细胞也存在于半影区，这些细胞均未表达NRG。因此在星形胶质细胞和小胶质细胞中诱导NRG可能是对缺血性损伤的迟发性反应，并且像在创伤性脑损伤模型中那样可能在后来出现。

由此可见，NRG的增加是神经元性的，没有NRG与星形胶质细胞或巨噬细胞共定位。这些结果表明NRG在缺血性脑卒中后在神经元中诱导，可能参与神经保护和修复作用。

1.2 脑梗死后ErbB的上调

ErbB受体在正常成年大鼠脑中差异表达。在脑大部分区域的神经元胞体中可见ErbB2、ErbB3、ErbB4的标记，而脑白质中胶质细胞中存在ErbB3和ErbB4，而灰质中不存在ErbB3和ErbB4。Xu等[5]使用MCAO模型来检测缺血性卒中后ErbB受体的分布，在缺血区观察到ErbB4蛋白的上调。Davies和Liu[6-7]研究发现ErbB4蛋白在梗死周围皮层和纹状体中均显著升高,梗死周围皮质的染色明显高于对侧皮质的相应区域。在单个细胞中，标记的细胞数量和标记强度都有所增加，且观察到ErbB4阳性细胞萎缩和三角形，这是受损神经元的特征。同侧梗死周皮层ErbB4阳性细胞胞浆和胞核均有免疫反应性。正常脑组织ErbB2和ErbB3免疫阳性细胞较少，轻度染色，缺血后受体无明显改变。用FJB染色(Fluoro-Jade B)作为神经退行性变的标志，在FJB阳性细胞中ErbB4上调，提示ErbB受体在受损神经元中诱导。在神经元和巨噬细胞/小胶质细胞亚群中可见ErbB受体增加,没有ErbB与GFAP阳性星形胶质细胞共定位。

这些结果表明ErbB受体在缺血性脑卒中后在神经元和巨噬细胞/小胶质细胞中上调，可能与NRG一样参与神经保护和修复作用。

2 NRG/ErbB在脑梗死的保护作用机制

在MCAO模型中发现，脑梗死后梗死起始于纹状体的皮层下。皮层下梗死发生在MCAO后几分钟内，由谷氨酸依赖性兴奋毒性神经元损伤介导。损伤随后扩展到包括同侧大脑皮层的大区域。这种延迟的细胞死亡阶段在接下来的几个小时内发生。延迟、缺血诱导的神经元死亡是由炎症和凋亡机制介导的。

NRG是一个生长和分化因子家族，与酪氨酸激酶受体EGF家族的成员结合[8]。EGF可促进培养的新生大鼠脑端脑神经元的生长，并保护神经元免受缺氧引起的损伤和氰化钾的神经毒性。除了这些体外发现外，EGF还具有缺血脑的神经保护功能。神经营养素-1β(NRG-1β)是一种已知参与神经细胞存活和功能的生长因子家族成员。NRG-1β及其受体ErbB受体在创伤性脑损伤后神经细胞中被诱导[9-10]，在MCAO大鼠梗死周围(半暗带)也被诱导[11-12]。在体内外具有抗中枢神经系统炎症的特性，并参与对脑梗死的保护作用。虽然NRG/ErbB的神经保护作用已被证明，但其确切机制仍不清楚。

2.1 改善神经功能和降低脑梗死体积研究

为了评价NRG-1的神经保护作用，Shyu等[13]采用脑内注射NRG-1蛋白，通过阻塞大脑中动脉(MCAO)诱导局灶性脑缺血，测定脑缺血48 h后各实验大鼠的运动功能。结果发现用NRG-1预处理的大鼠的运动活动，包括水平活动和垂直活动，明显高于对照组。通过TTC染色以及梗死的发病率(用发生梗死的动物数量除以研究的动物总数来表示)研究发现，在NRG-1预处理之后，给定截面的最大梗死面积显著地从对照值(22.3±3.9)mm2减少到(9.0±1.1)mm2。此外，NRG-1大鼠的梗死节段数从每只对照大鼠的(6.4±0.5)节减少到(3.0±0.3)节。以上数据表明，在脑缺血前30 min用NRG-1预处理不仅可减少缺血大鼠脑的体积，而且可减少梗塞的程度。Li等[14]建立MCAO/R动物模型,通过NRG-1治疗组与对照组来评估脑缺血后的神经功能。在MCAO/R后24 h，以Longa等的标准[15]进行行为评估，得出对照组大鼠出现多种神经症状和体征，不良反应评分为1。NRG-1治疗后，神经症状改善，评分明显降低,与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05);缺血1 h，治疗组神经功能明显改善(P<0.01);NRG-1治疗组与对照组相比，梗死面积减小(P<0.05)，尤以缺血1 h减少明显(P<0.01)。Guo等[16]采用大鼠局灶性脑缺血模型研究发现，与载体治疗组动物相比，接受NRG-1治疗的大鼠在再灌注24 h的神经功能缺损明显改善。NRG-1治疗后神经功能评分较治疗前的2.5(SEM：0.48)提高到1.22(SEM：0.43)，与模型组比较P<0.05。用TTC评价大鼠MCAO及再灌注后神经元的损伤。MCAO作用90 min,再灌注24 h,造成实验动物大脑皮质和纹状体广泛梗死。与对照组相比，NRG-1预治疗梗死体积缩小(P<0.01)。这些研究结果表明，NRG体内外治疗均能改善脑梗死后的神经功能，起到保护作用。

张昕垚等[17]通过观察两种不同频次针法治疗脑梗死患者，即1日1次和隔日1次，结果发现不同频次针法脑梗死患者总体神经功能缺损、日常生活能力及预后均有明显改善,且两组均能提高患者临床疗效,但每日针刺1次改善程度及临床疗效更明显。张铭铭等[18]观察头针电刺激不同时间点对急性脑梗死大鼠血清CD62P和CD63水平、神经功能缺损的调节作用，结果表明头针电刺激能降低CD62P、CD63表达,改善脑梗死大鼠神经功能。

2.2 抗凋亡机制研究

2.2.1 降低缺血诱导的细胞凋亡 相关动物实验研究[16,19]表明用TUNEL分析观察NRG-1预处理和对照组大鼠脑缺血后脑细胞凋亡的变化。用NRG-1预处理的缺血大鼠缺血核心周围的半影区几乎不含TUNEL阳性细胞，类似于正常脑。然而，从注射了载体的动物的缺血脑组织中，在半影区和缺血核心区确实含有许多TUNEL阳性细胞。在数量上，用载体预处理的动物比用NRG-1预处理的动物具有更多的TUNEL阳性细胞。TUNEL阳性细胞主要分布于大脑皮质缺血核心区，标记主要见于神经元细胞核。在同侧半球的其他区域或对侧没有发现TUNEL阳性细胞。这些发现表明NRG-1能保护神经元免受凋亡。

2.2.2 抑制caspase-3及 caspase-3mRNA的表达 Caspase-3是凋亡级联反应中的关键蛋白酶。线粒体介导的、细胞表面介导的和内质网应激诱导的信号转导通路在caspase-3的激活中汇聚。MCAO可激活caspase-3介导的细胞死亡以及caspase无关的凋亡信号通路，导致梗死核心坏死，而选择性caspase-3抑制剂可阻止短暂MCAO后的细胞凋亡。Guo等[16]的实验，大鼠在MCAO前10 min用NRG-1或载体治疗。用RT-PCR法检测RNA和caspase-3 mRNA的表达。结果表明，脑缺血诱导同侧脑组织caspase-3表达较强，而对侧脑组织caspase-3表达较少,与载体治疗组相比，NRG-1治疗组大鼠缺血诱导的caspase-3 mRNA水平降低。NRG-1既不影响同侧缺血半球β-肌动蛋白水平，也不影响对侧完整侧caspase-3 mRNA水平。类似的结果也见于Shyu等[13]的实验中，为研究NRG-1的神经保护机制，12只大鼠MCA结扎后8 h处死进行caspase-3免疫反应性试验。经NRG-1治疗的大鼠的缺血核周围的半影有少量caspase-3细胞表达。然而，对照组动物的缺血脑组织在半暗带和缺血核心中含有许多caspase-3阳性的细胞。这些结果提示NRG-1抗脑缺血凋亡机制可能与抑制caspase-3的活化有关。

2.2.3 上调XIAP表达抑制线粒体凋亡途径 X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)是一种内源性凋亡抑制蛋白，被认为是caspase最有效的抑制剂。越来越多的证据表明，XIAP不仅可以干预线粒体caspase通路的发展，而且可以调节与神经存活相关的转录因子的次级活性[6]。XIAP被证明在细胞凋亡复合物中有结合和抑制具有活性的caspase-9和caspase-3的功能。Li等[14]实验研究表明缺血诱导细胞凋亡和XIAP的表达。NRG-1可显著增加XIAP蛋白的表达，尤其在缺血1 h时更为明显，提示NRG-1可能通过上调XIAP活性而抑制线粒体凋亡途径的形成，在脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。

韩林等[20]通过实验表明“醒脑开窍”针刺法对脑缺血再灌注损伤大鼠有明显的脑保护作用,其机制可能与减轻神经细胞凋亡密切相关。武晓娜等[21]从促进神经组织再生、抑制神经细胞凋亡等方面进行综述，表明针刺能够抑制缺血半暗带神经细胞的凋亡,对梗死灶周围缺血的神经组织有保护作用。

2.3 抑制缺血诱导的炎症反应

2.3.1 抑制缺血诱导的胶质反应 缺血损伤导致以兴奋毒性为特征的早期发病神经元死亡，由此导致的缺血性脑损伤在受伤的大脑中引发炎性级联反应，并在症状出现后持续数天。这种炎症反应导致小胶质细胞/巨噬细胞的浸润和激活，星形胶质细胞的激活，以及随后的凋亡神经元死亡。NRG-1能抑制巨噬细胞浸润，阻断巨噬细胞和小胶质细胞表达促炎基因。Xu等[22]使用鉴定巨噬细胞和活化小胶质细胞的ED-1抗体，观察到MCAO/再灌注后，同侧半球的巨噬细胞/小胶质细胞数量众多，而对侧半球未见到巨噬细胞/小胶质细胞。ED-1阳性细胞呈阿米巴状(活化巨噬细胞和分枝小胶质细胞的特征)，分布于外侧皮质和纹状体。然而，在使用NRG-1β时，几乎没有看到ED-1阳性细胞。在NRG-1β处理的组织中发现的罕见的ED-1阳性细胞是圆形的，类似于单核细胞，而不是活化的巨噬细胞或分支小胶质细胞。

2.3.2 抑制缺血诱导的IL-1表达 IL-1是一种促炎性细胞因子，已被证实是缺血性脑损伤诱导神经元凋亡的重要介质。IL-1β在啮齿动物脑缺血的脑中迅速诱导，给予外源性IL-1β会增强缺血性脑损伤[23]。相反，通过给予IL-1β受体拮抗剂会阻断IL-1β，可抑制缺血引起的神经元损伤和炎症[23-24]。此外，缺乏caspase-1基因(它将不活跃的前IL-1裂解为成熟的活性形式)的小鼠也显示出减轻缺血性脑损伤[25]。IL-1β/IL-1α双敲除小鼠在MCAO后表现出梗死面积减少[26]。Xu等[22]研究发现RT-PCR检测IL-1β mRNA，显示脑缺血后同侧脑组织IL-1β明显升高，而对侧脑组织IL-1β很少见到。NRG-1与经载体处理的动物相比，缺血诱导的IL-1β mRNA水平降低了50%。这些研究表明，NRG-1诱导的神经保护机制可能涉及抑制IL-1的产生。

此外，NRG抑制缺血诱导的炎症反应还可能涉及其他炎性因子，这些细胞因子诱导粘附分子、下游促炎分子和应激基因的表达，因此NRG的抗炎机制很可能是使这些细胞因子失活或阻断细胞因子受体，从而减轻缺血损伤。

3 针刺调控NRG/ErbB通路对脑梗死后的神经保护作用研究

研究发现电针能够上调NRG-1和ErbB2的表达，NRG-1和ErbB2受体结合并激活下游信号通路，NRG-1/ErbB2信号通路对施旺细胞生存信号传导非常重要，该通路能够促进施旺细胞分化、增殖和迁移，增强施旺细胞生存[27-28]。张丽丽等[29-30]探讨醒脑开窍针法对缺血/再灌注大鼠大脑皮层NRG-1及其受体ErbB4蛋白表达的影响。结果显示针刺组大脑皮层缺血半暗带NRG-1的表达高于正常组、假手术组、模型组和非穴位组(P<0．05) ，穴位组 ErbB4 表达也高于正常组和假手术组(P<0．05)，提示电针刺激水沟和内关使皮层缺血半暗带内源性NRG-1的表达增加更显著，在缺血性脑损伤中发挥神经保护作用。

在脑缺血的发展中凋亡起着重要的作用。神经元凋亡的数目直接决定着梗死区域的面积和缺血后继发性损害的程度，所以及时遏制凋亡是挽救凋亡前期神经元的关键。针刺通过调控NRG/ErbB通路，上调内源性NRG及其受体ErbB的表达水平，一方面，在一定程度上抑制了神经元的凋亡，另一方面，通过增加NRG及ErbB的表达，抑制炎症因子释放和表达，抑制单核细胞浸润、星形胶质细胞活化后与细胞因子产生，从而抑制脑梗死后的炎症反应，起到神经保护作用。

4 结语

脑梗死的病理生理机制十分复杂，NRG/ErbB信号通路对脑梗死的神经保护机制可能涉及干扰NJFB，NJFB是介导许多炎症反应的转录因子。也可能通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号通路发挥其神经保护作用，该信号通路已被证明可促进细胞存活。NRG/ErbB信号通路还可能参与缺血后皮质神经元的可塑性，从而促进功能恢复。针刺调控NRG/ErbB信号通路对脑梗死的保护作用机制，涉及抑制凋亡、炎症反应和胶质反应以及调节神经营养因子等，其作用具有特异性，是一种迟发的神经保护作用，而针刺调控的内源性NRG/ErbB信号通路与外源性的NRG-1对脑梗死的神经保护作用机制是否相似，仍然需要深入研究。此外，进一步研究，还应当阐明针刺调控NRG/ErbB通路神经保护途径背后的信号机制及分子机制，探讨针刺调控脑梗死后NRG/ErbB通路的时间窗，推进针刺治疗脑梗死的机制研究，为临床脑梗死患者的治疗提供理论依据。