自噬在脑出血中的作用及针刺调节机制研究探析*

李明月，李 响，邹 伟

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.黑龙江省中医医院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

自噬来源于希腊语，早在50多年前，自噬现象就被美国科学家T. P. Ashford和K. R. Porter通过电子显微镜在大鼠肝脏细胞中观察到[1]。自噬在生理、病理上的重要功能逐渐被人类认识[2]。

1 自噬

1.1 经典自噬

自噬一般可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[3]，前两者清除蛋白底物均无选择性，而分子伴侣介导的自噬要求被降解的蛋白底物必须都含有特定的氨基酸序列，且能被HSC73识别并结合[4]，进而被降解。通常自噬过程分为自噬前体的形成、自噬小体的形成、自噬溶酶体形成3个阶段[5]。

1.2 经典自噬过程及分子调控机制

参与自噬的重要分子雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)上有几个重要的区域，分别为激酶区、FAT区、FATC区、HEAT重复序列区、FRB区。其中激酶区能够接受自噬起始信号，FAT区和FATC区可以调节mTOR激酶的活性。在酵母细胞中营养丰富时TOR激酶与Atg1结合，将其磷酸化成PAtg1,从而抑制自噬相关的下游信号；相反在饥饿状态时，TOR激酶被抑制，Atg1去磷酸化，进而诱导自噬的发生[6]。

1.2.1 自噬前体形成阶段 自噬调控基因 Atg6 /Beclin1主要参与这个阶段。Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(ClassⅢPI3K)是影响其活性的重要激酶。ClassⅢPI3K的催化亚基Vps34与Atg6/Beclin1的相应结构域结合后，可以催化质膜上的磷脂酰肌醇为磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)，PI3P可以组装含有PX和FYVE结构域的蛋白到自噬发生的位置，参与自噬前体膜形成[7]。

1.2.2 自噬小体形成阶段 该阶段需要Atg5-Atg12-Atg16连接系统和Atg8/LC3连接系统参与。前者主要定位于自噬体外膜，后者在自噬体内膜和外膜都有定位。在Atg5-Atg12-Atg16的连接系统中，在类E1泛素激活酶和类E2泛素结合酶的诱导下，Atg12经由Atg7和Atg10最终传递至Atg5，形成Atg5-Atg12复合物，同时Atg16的低聚物可以与大量的Atg5-Atg12复合物连接，形成更大的复合物，并连接在自噬前体双层膜上使其延长[8]。在Atg8/LC3连接系统中，LC3最初是以LC3-I的形式存在，处于一种非活化状态，在自噬出现时，LC3-I被Atg7和Atg3依次活化，在Atg5-Atg12-Atg16连接系统的协助下与磷脂酰乙醇胺(PE)结合，转化成具有膜结合能力的活化的LC3-II，共同参与双层膜的延长和自噬小体的形成[9]。

1.2.3 自噬溶酶体形成阶段 相对于自噬早期阶段，该阶段的机制研究较少。首先自噬小体成熟后，大部分Atg蛋白从自噬小体外膜脱落，而LC3-II继续停留于内膜上。最后自噬小体外层膜成功与溶酶体膜融合形成自噬溶酶体，自噬小体内层膜连同被降解底物一同在溶酶体中被降解[10]。

2 自噬在脑出血中的作用

2.1 脑出血中影响自噬的主要因素

脑出血(Intracerebral Hemorrhage，ICH)是一种破坏性的中风，导致世界范围内的高死亡率和高致残率。近几年越来越多的研究证明自噬在脑出血后的病理损伤中发挥了重要作用。早在2008年，HeY等[11]在实验大鼠基底节自体血注入3天和7天后，利用电镜在血肿周边的组织细胞内观察到自噬小体结构，首次证实了在 ICH 发生后自噬的激活。Ren C等[12]运用神经蛋白质组学方法(LC-MS/MS)研究在ICH大鼠模型脑损伤后蛋白质的差异表达,证明了出血性脑卒中蛋白确实参与了自噬过程。

ICH发生后红细胞裂解，大量游离铁释放。为了研究铁对脑出血后的神经损伤是否与自噬相关，有学者做了相关实验。在体内，通过对大鼠右侧海马体内分别注射生理盐水和亚铁进行观察；在体外，将大鼠胚胎的原始培养皮层神经元暴露于亚铁中。并在1、3、7天内对LC3进行了Western blot分析和MDC染色。结果在体内和体外均有LC3-I转化为LC3-II。MDC标记显示，将神经元暴露在铁元素中，会出现MDC的积累,说明脑出血后铁的积累可以诱导自噬产生，参与脑损伤[13]。有研究也支持这一观点，在实验大鼠大脑的自噬细胞死亡中，检测到铁含量增加[14]。另外，凝血酶也可在脑出血后大量释放，并弥散至血肿周围。研究表明在培养的星形胶质细胞中，凝血酶增强了LC3-I到LC3-II的转化，并增加了MDC标记的自噬液泡[15]。脑出血后周围组织由于血肿、水肿形成，占位效应明显，周围组织继发缺氧，研究表明缺氧可以通过激活缺氧诱导因子(HIF)的途径来影响自噬在慢性和中度缺氧中产生，进而通过调节受损细胞器和蛋白质的清除起到保护作用。此外，另外3个氧敏感信号通路也与自噬的激活有关。包括哺乳动物雷帕霉素靶激酶(mTOR)展开的蛋白质反应(UPR)和PKCδ-JNK1通路。此外与自噬的保护作用相反，在快速和严重的氧波动期间，自噬可能是有害的，并诱导细胞死亡[16]。

自噬的产生不仅与脑出血后的组织病理状态有关，有研究显示自噬的作用与性别有关，在探讨神经元自噬和雌激素介导的保护作用对抗铁纹状体损伤的关系过程中发现，在体内柠檬酸亚铁诱导雌性大鼠的自噬程度以及行为缺陷等均较雄性低[17]。另有研究也支持性别在脑出血作用中的差异[18]。在脑出血后，男性的存活率比绝经前的女性要低。自噬不仅与性别有关，自噬的作用与年龄也有关，有学者研究了衰老对脑出血后自噬的影响。 结果发现老年大鼠与幼龄大鼠相比，LC3-I/LC3-II的转化率在同侧基底神经节中较高。血肿周围组织蛋白酶D水平在老年大鼠中也较高。老年大鼠ICH后神经功能缺损较严重，功能恢复较慢[19]。不仅如此，廖远生等[20]针对脑出血中医辨证的不同证型的自噬差异还做了深入研究，发现在阳闭、阴闭和脱证中自噬泡数目和自噬相关蛋白CathepsinD表达存在显著差异，且与病情轻重呈正相关。

2.2 自噬在脑出血中的作用

2.2.1 自噬的破坏作用 自噬是机体对环境变化做出的一种应激反应，过度自噬会对细胞造成破坏；自噬不足，不能有效的清除受损的细胞器和破碎蛋白也会对细胞功能造成影响。白细胞介素-33(IL-33)是一种最近发现的IL-1家族成员，有研究表明 IL-33通过抑制炎症、凋亡和自噬作用，在胶原酶诱导的ICH模型中提供神经保护[21]。Yang Z等[22]通过研究发现,Toll样受体-4(TLR4)可能是参与了自噬的激活，进而引起小胶质细胞的激活介导了ICH炎症损伤。陆梦茹等[23]在脑出血与自噬关系的研究中发现抑制 C57BL/6小鼠的TLR4及自噬可减轻自噬引起的脑出血炎症损伤。对于脑出血自噬作用的通路，有专家通过在体内和体外实验研究中证明，自噬在脑出血模型中造成的神经损伤可能与NF-κB通路的调节有关[24]。另有研究表明miRNA-144可以通过mTOR调控脑出血后诱发的小胶质细胞自噬和炎症，造成脑损伤。miRNA-144的下调可以抑制ICH小鼠的炎症、脑水肿，改善神经功能[25]。除此之外，在治疗上，Wu Z等[26]研究发现在大鼠ICH模型中注射米诺环素可以显著减少ICH后脑损伤，根据注射米诺环素后beclin1、LC3II/I、caspase-3/8均被抑制，推测其保护作用与抗自噬和抗凋亡有关。Chang P等[27]在研究中还首次证明了抗坏死性凋亡的抑制剂-1能够抑制细胞凋亡和自噬，从而发挥ICH后神经保护作用。以上研究证实了自噬在ICH中的破坏作用，并指出有效的抑制自噬，可以发挥神经保护作用。

2.2.2 自噬的保护作用 自噬是一种溶酶体参与的细胞代谢途径，自噬的适度激活可使受损的细胞器和错误折叠的蛋白质被降解和回收，以维持细胞正常稳态。据研究证实，脑出血后可产生大量活性氧自由基，进而激活自噬，吞噬氧化应激产物，减轻ICH后脑损伤[28]。另有研究表明可以通过BECN1和ATG5激活小胶质细胞自噬为ICH提供保护作用[29]。不仅如此，有文章显示自噬的保护作用，与大脑损伤的不同部位有关[30]，有学者利用脑卒中的动物模型，评估自噬在大脑皮层和海马区的神经保护作用[31]。结果发现海马区和大脑皮层之间的自噬标记存在显著差异。在造模后的3 h内，自噬体和自噬通量在大脑皮层中有所增加。在海马区未观察到明显增加。仇志富等[32]利用补阳还五汤灌药研究自噬在脑出血中的作用发现，补阳还五汤能够通过CXCR4-PI3K信号通路激活自噬，起到脑保护作用。

3 针刺对脑出血自噬过程的双向调节作用

针刺作为一种绿色有效的治疗手段，已经得到广泛认可。世界卫生组织推荐针灸作为改善中风治疗的替代和补充策略[33]。关于针刺对自噬的影响，Luo D等[34]广泛搜索了PubMed、Embase、Science和CNKI,结果发现针刺对动物模型的自噬具有潜在的治疗作用。Li HQ等[35]对于针刺选穴百会治疗急性脑出血动物模型做了前瞻性的回顾和荟萃分析，最后得出，针刺百会是治疗急性脑出血的一种可选治疗方法。Liu H等[36]利用头针进行针刺，发现头针治疗可降低TNF-α和NF-κB 的表达，改善脑出血大鼠神经功能缺陷。牛明明等[37]采用自体血注入法制作脑出血大鼠模型，利用“百会”透“曲鬓”针刺法对其进行治疗，结果发现自噬相关蛋白LC3A/B在针刺组表达最高，且针刺组神经功能改善最明显，提示头穴透刺可以促进自噬作用，参与神经修复。包宇等[38]观察针刺“百会”透“曲鬓”对脑出血急性期大鼠P13K和P-AKT表达的影响，发现针刺可以提高两种蛋白表达水平，减轻脑出血后继发性损伤。邹伟等[39]研究发现头针透穴法可能对β-catenin表达有作用，进而激活 Wnt信号通路参与自噬。Niu M等[40]针对ICH后自噬、内质网应激和未折叠蛋白反应做了相关性研究，得出自噬能够在ICH后清除内质网应激引起的错误蛋白聚集，对细胞提供保护作用。而早期研究已经证实,PERK通路是激活自噬相关基因诱导内质网应激恢复稳态的主要通路之一[41]。相关基础实验对针刺在实验性大鼠脑出血模型中自噬作用影响做了进一步研究得出，随着大鼠脑组织损伤加重，PERK蛋白表达增加，自噬作用增强，而针刺“百会”透“曲鬓”可以明显缓解3-MA抑制剂对自噬的抑制作用和对PERK通路活跃度减低情况[42]。进一步验证针刺治疗可以通过激活PERK通路激活自噬，促进神经细胞修复。以上研究均说明针刺可以适度激活自噬起到保护神经元的作用。

另外针刺也可以适度抑制自噬发挥神经保护作用。Li HQ等[43]研究发现电针百会穴治疗脑出血可以通过干扰Caveolin-1介导的分子途径发挥神经保护作用。Caveolin-1已被证明参与自噬途径[44]。另外Zou W等[45]发现针刺抑制脑出血大鼠基底神经节Notch1和Hes1蛋白表达，参与脑神经保护。Notch1被证明可以诱导自噬的发生[46]。Li X等[47]研究证实芬戈莫德通过mTOR/P70S6k途径抑制自噬过度激活，可以缓解脑缺血再灌注损伤,证明了mTOR/P70S6k途径对于自噬的负性调控作用。而詹谷文[48]在脑出血大鼠实验中进一步证实，电针联合BMSCs移植治疗可以激活mTOR/P70S6k信号通路,提高突触可塑性，促进神经功能修复;为针刺抑制脑出血后自噬作用，发挥神经保护提供了实验基础。张国威等[49]在实验过程中发现针刺“百会”透“曲鬓”可能在脑出血急性期通过抑制内源性 MMP-9表达的途径发挥拮抗脑损伤作用。Li WD等[50]在研究二甲双胍抑制内皮祖细胞迁移的实验过程中证明，基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9可以通过AMPK/mTOR自噬途径降低。而针刺对脑出血脑损伤的拮抗作用，是否通过影响了自噬途径从而抑制MMP-9的产生，还有待于进一步研究。姜桂美等[51]在ICH急性期运用针刺进行干预治疗，结果针刺显著降低了血肿脑组织周围炎性细胞因子IL-1β 与 IL-6的表达,减轻了对脑组织的继发性损伤。Zhao X等[52]研究发现臭氧在大鼠软骨细胞中刺激IL-1β产生可以激活AMPK/mTOR信号通路诱发自噬;为IL-1β与自噬之间的关系提供了依据，也为针刺抑制IL-1β诱导的自噬提供了理论基础。

4 讨论

脑出血是中风的一种亚型，其发病机制和治疗手段已被广泛研究。自噬作为细胞内稳态的重要调节机制，在ICH中的作用也逐渐被认识。但研究相对较少，自噬对ICH后内环境稳态的调控作用还有待于进一步探讨，在ICH病理损伤的不同阶段和不同影响状态下，自噬所发挥的作用可能不是单一性质的。正如Duan XC等[53]研究发现，在ICH后6 h,过度的自噬参与氧化应激诱导的脑组织损伤，而在ICH后7天，自噬可能通过清除早期自噬通量损伤产生的代谢废物，发挥脑保护作用。所以动态观察脑出血后自噬相关蛋白的表达变化能更好的阐明自噬的作用。另外自噬是一把双刃剑[54]，如何适度的激活自噬发挥自体修复作用仍然很模糊，过度自噬不仅不能有效清除受损蛋白，还会对细胞造成损伤。但目前研究对于干预自噬程度的探讨不足，缺乏可供参考的文献。针刺在治疗ICH过程中发挥了一定作用。针刺可以直接影响自噬过程，也可以通过激活炎症因子、肿瘤坏死因子、内质网应激相关通路等其他机制间接干预自噬。尽管在实验研究中针刺治疗ICH已经取得了一些进展，但目前针对自噬这一作用机制，探讨针刺对ICH治疗作用的研究甚少。已有研究也多集中在对某一自噬相关基因或蛋白的影响，缺乏针对自噬经典通路或线粒体自噬等选择性自噬的研究。针刺的良性双向调节与自噬的正面和负面作用的关系如何体现，针刺如何调节自噬稳态，仍然存在疑惑。

针刺作为传统医学的重要组成部分在脑出血治疗上疗效显著，关于针刺良性调节脑出血后自噬稳态促进神经细胞自体修复这一重要作用希望能通过后续大量研究更好的阐明。同时更应该增加实验研究手段，不能单纯局限于western blot、PCR等，为临床针刺治疗脑出血效果显著提供更加深刻的理论支持。自噬在脑出血中作用研究可以为临床脑出血的治疗提供新的方向。