泛素蛋白酶体途径的应用研究进展

董慧琳 聂红明 梅昭荷 赵彬彬 姜煜资 陈建杰 王灵台

1.上海中医药大学附属曙光医院肝病科，上海 201203；2.上海中医药大学曙光临床医学院，上海 201203

机体中蛋白质的降解主要有以下三条途径：溶酶体途径，非溶酶体、非能量依赖性的Ca2+依赖性蛋白酶途径和泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway，UPP）。UPP 是一种依赖ATP 进行的，具有高度特异性和选择性的蛋白质降解途径，主要负责降解细胞内超过80%的正常或异常蛋白质[1]，并在细胞周期调控、信号转导、核酸密码翻译等多种生命过程中发挥重要作用[2]。目前对该体系探索与研究有限，本文就UPP 对神经退行性变、肿瘤、病毒感染、心脑血管疾病等方面进行阐述，以期为其后续研究与疾病治疗提供思路。

1 UPP 的组成

UPP 包括泛素（ubiquitin，Ub）、泛素活化酶（ubactivating enzyme，E1）、泛素结合酶（ub-conjugating enzyme，E2）、泛素连接酶（ub-ligating enzyme，E3）、26S蛋白酶体（26S proteasomes）和去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）。

1.1 UPP 作用机制

在ATP 的参与下，Ub 在泛素启动酶的一系列介导反应下被激活，与靶蛋白共价结合，完成单泛素化。泛素化与磷酸化相似的是它们都属于可逆过程，通过泛素化酶和去泛素化酶维持平衡。单泛素化不能降解靶基因，只是起到调节作用[3]。当至少有4 个被激活的泛素连接到靶蛋白上形成多聚泛素链时，底物将被输送至26S 蛋白酶体降解，而多聚泛素链在泛素再循环酶的作用下分解成单个泛素分子，再重新循环利用[4]，此为UPP 的经典途径。

Jiang、文津等[5-6]发现，在经典途径以外，泛素可以以胞内游离状态形成一种非固定性聚泛素链，与靶蛋白直接结合，该聚泛素链可以通过活化激活蛋白激酶1和IKK 激酶，调节核因子κB（NF-κB）信号通路。但目前对该途径的研究有限，其作用机制与功能是否有别于经典途径尚待深入探索研究。

2 UPP 异常所致的疾病

泛素-蛋白酶体途径是真核细胞依赖ATP 降解蛋白的途径，该途径异常会导致体内蛋白质的异常堆积，从而引发多种疾病。目前研究发现，UPP 异常会影响人体的神经系统、免疫系统，影响心、肝、肾等器官，甚至与肿瘤的发生也息息相关。

2.1 UPP 与神经退行性变

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一种常见的神经系统变性疾病，最主要特征为中脑黑质多巴胺（dopamine，DA）神经元变性死亡以及路易小体的形成。临床表现主要有静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态障碍等运动症状，同时也可伴有非运动症状如情绪低落、焦虑、失眠、认知障碍等。PD 的确切病因尚不清楚，已知相关因素有环境、年龄、氧化应激等，遗传也起着重要作用。目前已确定的PD 致病基因有αsynuclein、Parkin、泛素羧基端水解酶（UCH）L1、DJ-1、PINK1、LRRK2、ATPl3A2 及HTRA2 等16 种。α-synuclein 是PD 的重要致病基因，也是路易小体的重要组成部分，Rideout 等[7]与赵杰等[8]研究发现α-synuclein形成的包涵体对细胞具有毒性，可致细胞凋亡。UPP异常致使α-synuclein 异常积聚，可能在一定程度上通过细胞凋亡途径导致DA 变性缺失。Gliekman 等[9]发现UCH-1 基因出现异常，会导致相应蛋白酶活性降低，游离泛素减少，UPP 功能异常，毒性蛋白聚集而发病。Setsuie 等[10]发现193M 和S18Y 作为UCH-L1的2 个基因突变点位，193M 可能是PD 的致病因素，而S18Y 则可能是疾病的保护因素，因为在S18Y 型中蛋白水解酶活性增强，α-synuclein 稳定性下降，使异常蛋白质聚集量减少。Payami 等[11]研究发现，Parkin蛋白作为E3 泛素蛋白连接酶的一员，其底物蛋白通过UPP 降解。故一旦Parkin 基因突变，Parkin 蛋白功能障碍，底物蛋白无法顺利通过UPP 降解，会在细胞内聚集，最终致DA 神经元死亡。王雪晶等[12]的研究通过GST pull-down 实验以及免疫共沉淀的方法验证BAG5 与Parkin 在细胞内外均有特异性的相互作用，证实BAG5 可延长Parkin 细胞内的降解半衰期，稳定其细胞内水平，为PD 的治疗提供新的研究思路。

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是临床上最常见、最典型的神经系统退行性疾病，临床症状主要有失语、记忆障碍、认知功能障碍和痴呆等，主要病理特征为神经元外β 淀粉样蛋白（amyloid β protein，Aβ）沉积形成老年斑（senile plaque，SP）和神经细胞内神经原纤维形成缠结（neurofibrillary tangle，NFT）。Golab等[13]在SP 和NFT 中发现泛素和某些蛋白酶体亚基，提示AD 患者脑中UPP 一旦出现异常，无法及时降解Aβ 等异常蛋白，导致神经细胞凋亡。陈勤等[14]经实验发现UPP 参与AD 的发生过程，中药远志的主要活性成分远志皂苷能明显降低AD 大鼠脑内Aβ1-40沉积和tau 异常磷酸化水平。Bergman 等[15]发现一旦蛋白酶活性被抑制，PS1 与PEN2 蛋白酶体底物水平会相应升高，Aβ 数量增多引起疾病。除AD、PD 外，多种神经退行性疾病的发生均与蛋白质异常聚集相关[16]，但UPP 致病的作用机制尚需深入研究，蛋白酶体调节剂或抑制剂能否作为神经保护剂可能成为新的研究方向。

2.2 UPP 与肿瘤

泛素结合酶E2C（ubiquitin-conjugatingenzymeE2C，UBE2C）属于UPP 组成中E2 家族成员。Chen 等[17]研究验证并进一步表明，在正常组织中UBE2C 表达非常低，但在肿瘤组织中偏高，在肝癌组织中表达率高达90%之上、在结直肠癌组织中表达率高达91%。Fujita 等[18]运用免疫组化分析，也发现UBE2C 在结肠癌、乳腺癌组织中表达显著增高。Rajkumar 等[19]研究发现UBE2C 在3 期宫颈上皮内瘤样病变组织中表达显著增高，可用于早期宫颈癌诊断。Skp1-Cullins-F-box蛋白复合物（SCF 复合物）E3 泛素连接酶是最大的泛素连接酶家族成员，可促进多种蛋白进行泛素化降解，对细胞周期、DNA 复制等多种生物过程具有重要调节作用，与肿瘤关系密切[20]。刘庆滨等[21]证实F-box成员之一的Skp2，负责底物的识别和泛素化降解，参与细胞周期调控，在检测120 例胃癌和30 例正常胃黏膜组织后发现Skp2 在胃癌组织中阳性表达与肿瘤的分化程度呈正相关（χ2=9.875，P=0.002），影响胃癌细胞的发生发展。冯爱强等[22]采用半定量逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测40 例乳腺癌组织、20 例乳腺纤维腺瘤组织和20 例正常乳腺组织中的Skp2mRNA 表达，得出Skp2 参与乳腺癌发生发展的结论。E3 泛素连接酶c-Cb1 参与多种蛋白的泛素化降解，并参与受体酪氨酸蛋白激酶的信号转导[23]。有报道称c-Cb1 与肿瘤的发生发展关系密切[24]。Ximing 等[25]经实验发现肺癌中c-Cb1 会引起P-EGFR、P-ERK 两种蛋白表达水平下调，从而抑制肿瘤细胞增殖通路活化。Jiao 等[26]通过对94 例非小细胞肺癌患者的观察发现c-Cb1 可以下调表皮生长因子受体活化，从而抑制肿瘤细胞增殖。李岚等[27]应用免疫组织化学法，检测124 例胃癌组织中c-Cb1 蛋白表达，发现其在胃癌组织中的阳性率达71.0%，建议将其作为胃癌早期诊断指标。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL），又称Apo2L，是肿瘤坏死因子超家族成员，当它与相应受体结合后可诱导多种肿瘤细胞凋亡，且对正常细胞无影响[28]。Hao 等[29]用MTT 法测定细胞生长抑制效应，用Western Blot 检测Caspase-4、Caspase-8，得出结论UPP 参与TRAIL 诱导癌细胞凋亡过程，并指出Caspase-4、Caspase-8 是该过程中的关键分子。另有研究[30]发现泛素连接酶Cb1 家族与TRAIL 的关系，称TRAIL可上调Cb1 蛋白表达，从而抑制Jurkat T 细胞中PI3K/Akt 信号过度活化，诱导肿瘤细胞凋亡。细胞内蛋白分子有序降解是保证细胞功能的关键，UPP 异常影响多种凋亡调节蛋白和转录因子的降解，从而影响肿瘤细胞的凋亡。UPP 在肿瘤发生发展中的作用日益得到关注，并成为肿瘤治疗的靶点之一，值得深入研究。

2.3 UPP 与病毒感染

病毒是由核酸分子（RNA/DNA）和蛋白质构成的没有细胞结构的物质，必须依靠宿主细胞，借助其复制系统才能繁殖存活。当其侵入人体时，须通过人体三道免疫防线：皮肤黏膜及其分泌物、以干扰素和NK细胞为主的先天性免疫和特异性免疫。宿主细胞通过NF-κB、IRF3 和IRF7 诱导干扰素的产生，清除病毒，而同时病毒也会通过编码模仿（如编码泛素连接酶E3 功能域）或改变宿主E3 连接酶底物蛋白的特异性等方式，从宿主的免疫攻击下逃脱[31]。

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）又称涎病毒，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒。MHCⅠ类和Ⅱ类分子在免疫系统中的关键作用是将病毒抗原提呈至细胞表面，最终使病毒被CD8＋和CD4＋T细胞识别并杀伤。HCMV 进入人体后会合成4 种病毒蛋白，分别为US2、US3、US6 和US11，这4 种病毒蛋白分别作用可抑制MHCⅠ类和Ⅱ类分子的抗原提呈[32]。US3 使MHCⅠ类蛋白滞留于内质网，随后US6变构影响MHCⅠ类分子装配，US2 和US11 随之协同诱导MHCⅠ类分子错位，通过UPP 进行泛素化降解，使HCMV 不被CD8＋T 细胞识别杀伤。另一项研究[33]指出人体感染HCMV 后，其病毒基因表达的pp65 蛋白也参与到US2、US3、US6 和US11 的 抑制MHCⅠ类分子向CD8＋T 细胞抗原提呈的过程。在抑制MHC Ⅱ类分子的抗原提呈方面，US2 和US3 可协同作用，通过UPP 降解Ⅱ类蛋白DR-α 和DM-α[34]，致使只有少量的DR-α 和DM-α 被CD4+T 细胞识别，从而逃脱被识别杀伤。

乙肝病毒（hepatitis Bvirus，HBV）属于嗜肝DNA病毒科，含有S、C、P 和X 这4 个开放读码框架，其中X 区编码生成的HBX 蛋白是最小的HBV 编码蛋白。Robinson 等[35]在上世纪即发现禽类在感染嗜肝DNA病毒后不会产生HBX 蛋白，疾病不会发展成肝癌，推断出HBX 蛋白在肝癌的发生中起重要作用。陈江等[36]经实验证实HBX 蛋白可上调Survivin 和p53 蛋白表达，促进肝癌的发生发展。当HBV 侵入人体，细胞会通过UPP 选择性降解HBX 蛋白，抑制HBV 病毒在体内复制，而同时，HBX 蛋白与蛋白酶体的PSMA7 和PSMC1这两种亚基相互作用[37]，降低蛋白酶体活性，抵御免疫系统的攻击。另有研究[38]发现HBX 蛋白会挟持损伤DNA 结合蛋白（damaged DNA binding protein，DDB）成员之一的DDB1，利用其参与泛素化修饰调控基因转录、修复和信号转导等功能，复制自身免受免疫攻击。

曹雪涛[39]等历经10 年研究发现一种新的E3 泛素连接酶Nrdp1，在Toll 样受体（Toll like receptor，TLR）的信号传导过程中起重要作用，可促进MyD88（Myeloid differentiation primary response gene 88）的泛素化降解，激活TANK binding kinase 1（TBK1），从而抑制炎性因子产生，促进Ⅰ型干扰素生成，在抗炎和抗病毒方面有很好的作用。

其他如单纯疱疹病毒（HSV）、EB 病毒、人获得性免疫缺陷病毒（HIV）等或利用UPP 或通过自身修饰逃逸UPP 或攻击UPP[34]，复制自身病毒，逃脱人体免疫系统。UPP 与病毒、免疫系统之间的关系十分密切，虽然其具体机制不明确，但为病毒及相关疾病治疗提供了很好的研究方向，随着研究的深入，相信会有更好的抗病毒药物问世。

2.4 UPP 与心血管疾病。

BRCC36 是2003 年发现的去泛素化酶成员，属JAMM（Jab1/MPN/Mov34 metalloenzyme）/MPN+（Mpr1/Pad1 Nterminal）亚类，通过形成26S 蛋白酶体和COP9信号体后具有去泛素化活性，参于DNA 损伤修复、细胞信号转导及细胞周期控制等多种细胞活动[40]。有研究[41]发现在TGF-β 信号通路中，胞质内的BRCC36 与Smad3 结合增多，提示BRCC36 参与、共同作用于靶基因转录表达水平的调控。而TGF-β 可以促进Treg成熟，协助Treg 的存活[42]，发挥其调节机体免疫功能，控制动脉粥样硬化的发生发展[43]。另有报道[44]TGF-β1在急性脑缺血时表达增加，促进微血管增生，减轻脑缺血损伤。Miskinyte 等[45]发现BRCC36 基因敲除斑马鱼血管生成障碍，提示其在血管形成过程中发挥重要作用。

NF-κB 广泛存在于细胞质，调节多种蛋白基因转录，参与多种炎性反应的信号转导过程，其游离活化只在IκBα 被26S 蛋白酶体降解后才发生，提示UPP在激活NF-κB 的过程中发挥重要作用[46]。有研究显示[47]NF-κB 可调节抗动脉硬化因子IL-10，并在动脉粥样硬化继发缺血性脑卒中引起的脑损伤过程中发挥重要作用[48]。心肌细胞遭受刺激，会导致IκBα 被泛素化降解，激活NF-κB 参与调控心肌细胞凋亡，从UPP 在NF-κB 激活中的作用角度考虑，结合NF-κB对于心肌细胞的调控作用，为心血管疾病的治疗提供新思路和治疗靶点。

抑癌因子p53 与UPP 关系密切，转录辅助激活因子P300 通过UPP 影响mdm2 调节的p53 转换[49]，用特异性蛋白酶体抑制剂MG132 或lactacystin 使UPP 失活会使p53 转录活性降低，提示UPP 不仅影响p53 转换，且参与转录过程。有实验[50]测定高血压患者（50 例）与正常组（50 例）外周血涂片淋巴细胞中p53蛋白表达，发现高血压组阳性细胞率为（59.9±24.4）%，显著高于正常组的（22.8±15.2）%（P ＜0.01），得出结论在高血压患者中存在p53 基因突变，与高血压患者的左室肥厚呈正相关。p53 还可指导促凋亡基因Bax的转录而促使心肌细胞凋亡，对包括高血压在内的多种心血管疾病起重要作用[51]。

从UPP 角度对心血管疾病领域的相关研究仍较少，更多实验研究的开展，可为该领域的疾病防治拓宽新途径。

2.5 UPP 与其他疾病

张志坚等[52]建立“失血性休克-内毒素”二次打击大鼠模型，将24 只SD 大鼠随机分为对照组（C 组）和二次打击组（HS 组），蛋白免疫印记测定大鼠膈肌组织中E2-14k 及MuRF1 蛋白表达，结果显示：HS 组分别为（1.65±0.38）、（1.88±0.32），C 组分别为（1.17±0.25）、（1.21±0.24），差异有统计学意义（P ＜0.01）。Rt-PCR分析大鼠膈肌组织中泛素及蛋白酶体C2 亚基的mRNA 表达显示，HS 组分别为（0.81±0.28）、（0.50±0.25），C 组分别为（0.89±0.20）、（0.50±0.15），差异有统计学意义（P ＜0.05）。得出结论二次打击大鼠膈肌组织内UPP 被激活，导致膈肌收缩蛋白降解增加，肌力降低，肺损伤加重，增加呼吸衰竭发生概率。

Fang 等[53]研究发现早期胰岛素强化治疗可使糖尿病肾病大鼠模型中p38MARK 活化水平减轻、MKP-1 蛋白表达水平下调。MKP-1 作为一种不稳定蛋白，降解通过UPP 进行调节，泛素蛋白酶体可增加或减少MKP-1 蛋白水平，使MAPK 通路脱磷酸化减少，导致该通路出现持续活化状态[54]，在糖尿病肾病的发病过程中起关键作用。

有研究发现特异性泛素蛋白酶22（USP22）mRNA和蛋白在初诊急性白血病患者中有表达，且较阴性对照组表达偏高，其中高白细胞患者USP22 基因表达水平较非高白细胞患者高，推测USP22 基因表达水平可能与白细胞数目有关，可作为判断急性白血病患者预后标志基因之一[55]。

转录因子PPARγ 可通过激活其下游靶基因，决定脂肪生成和细胞分化，另外也参与调节能量平衡及脂质生物合成[56]。实验发现抑制UPP 会降低细胞可溶性组分中PPARγ 的含量，而增加非可溶性组分中PPARγ 含量[57]，提示UPP 可通过调节PPARγ 水平而影响脂肪细胞的分化。

3 小结

泛素蛋白酶体系统自发现以来，一直是研究热点，本文就UPP 对神经退行性变、肿瘤、病毒免疫、心脑血管疾病等方面进行阐述，但该体系结构复杂，参与细胞内超过80%蛋白降解，所涉疾病、信号通路、基因等较庞大，且对其研究仍远远不够，对其仍知之甚少。未来着重要研究UPP 各成员组成及具体功能，明晰作用机理，探索相关分子靶向药物，为疾病治疗提供新的研究方向。