肠球菌生物被膜研究进展

丁 丽， 林东昉

生物被膜（biofilms）是指细菌在生长过程中附着于生物体表面（如伤口表面）或非生物体表面（导尿管、中心静脉导管、人工心脏瓣膜等医用植入装置），由自身产生的胞外聚合物（包括核酸、蛋白质、多糖和脂类）包裹细菌组成的一个细菌群体。生物被膜的形成为细菌提供了保护作用，生物被膜抵抗抗生素作用以及宿主免疫防御，并涉及许多细菌和真菌慢性感染[1]。

肠球菌是一种重要的条件致病菌，主要包括粪肠球菌和屎肠球菌，能够引起尿路感染、腹腔感染、血流感染以及感染性心内膜炎，尤其是免疫功能低下的患者[2]。根据2017 年中国CHINET细菌耐药性监测显示，肠球菌在医院分离革兰阳性临床菌株中位列第二，其中，粪肠球菌占42.3%，屎肠球菌则占50.7%[3-4]。现有资料显示，高达65%～80%感染与生物被膜形成有关，突出了其巨大的临床影响[5]。随着研究的不断深入，发现肠球菌生物被膜的形成是尿路感染、心内膜炎等感染慢性化的重要原因[6]。本文主要介绍肠球菌生物被膜的最新研究进展及其临床意义。

1 肠球菌生物被膜及其流行性

1.1 生物被膜的形成

生物被膜形成是一个多阶段的过程，主要包括黏附、成熟以及脱落三个过程[7]。首先，细菌可逆性附着于生物体或者非生物体表面，随后细菌自身诱导产生的胞外聚合物使得细菌更加坚固地聚集在一起，其结构提供了一个最佳的微环境，促进细菌之间遗传因子的传播，当生物被膜内微环境出现不利因素（缺氧、营养物质不足等）时，细菌从生物被膜中脱落，随血流等进入循环系统，引起血流感染，同时能黏附在机体其他部位，再次形成生物被膜[6，8]。

肠球菌通常具有很强的生物被膜形成能力，其中粪肠球菌较屎肠球菌具有更高的生物被膜形成能力，且两者的流行程度在区域上有所不同。研究显示，欧洲地区粪肠球菌具有很高的生物膜形成能力，英国109株肠球菌血液分离株中，100%粪肠球菌具有形成生物被膜的能力，42%屎肠球菌可形成生物被膜[9-10]。美洲的粪肠球菌分离株也同样具有很高的生物被膜形成能力，研究显示不同来源的163株粪肠球菌分离物中有93%可形成生物被膜[11-12]。然而，分离自西班牙的粪肠球菌分离株只有57.2%具有形成生物被膜的能力，研究中39株屎肠球菌分离株不能产生生物被 膜[13]。

我国深圳某医院265株粪肠球菌临床分离株中47.2%具有形成生物被膜的能力[14]，在此之前浙江温州某医院348株肠球菌临床分离株中有54.6%可形成生物被膜，其中粪肠球菌生物被膜形成率为75.6%，屎肠球菌生物被膜形成率为37.5%[15]。

1.2 生物被膜的组分

生物被膜主要由膜内细菌、酶、胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）、蛋白质、胞外DNA（eDNA）以及水通道组成[16]。EPS形成的水合网络促进细胞与细胞之间的黏附，并为生物被膜提供结构支持。生物被膜EPS形成含有大量阴离子和阳离子分子的致密屏障，可以结合带电荷的抗菌剂，并为微生物提供遮蔽，提高生物被膜内细菌对抗生素的耐受性。

2 与肠球菌生物被膜形成相关的分子

2.1 毒力分子

目前普遍研究认为与肠球菌生物被膜形成相关的毒力分子主要包括溶细胞素（cytolysin）、聚集物质（aggregation substance）、表面碳水化合物（surface carbohydrates）、细胞外超氧化合物（extracellular superoxide）以及表面蛋白（extracellular surface protein）等。

肠球菌表面蛋白是由染色体基因esp编码的大分子表面蛋白，由1 873个氨基酸组成并具有N-末端结构域，属于Alp蛋白家族。ESP参与生物被膜形成，并且与尿路感染及心内膜炎的发病机制有关。研究认为esp基因对生物被膜的形成有很大作用，常见于具有形成生物被膜能力的临床粪肠球菌中，esp基因能够促进粪肠球菌在非生物体表面上初步附着和生物被膜形成[13]。但是又有部分学者认为esp基因对于生物被膜的形成意义不大[11，17-18]，或ESP不是生物被膜形成所必需的[11，19-20]。

明胶酶（GelE）是由染色体基因gelE编码，能够水解明胶、胶原蛋白和酪蛋白的细胞外锌金属蛋白酶。GelE和丝氨酸蛋白酶（SprE）由操纵子gelE-sprE编码，其表达由fsr基因座编码的群体感应系统（quorum sensing system）正向调控。fsr基因座由4个基因fsrABDC组成，最初被鉴定为金黄色葡萄球菌Agr群体感应系统的同源物[21]。fsr群体感应系统由明胶酶生物合成激活信息素（gelatinase biosynthesis activates pheromones，GBAP）调控，并且与兔眼内炎和心内膜炎模型中的毒力以及体外生物被膜形成相关[22]。据推测，FsrB具有半胱氨酸蛋白酶活性，使其能够将fsrD编码的GBAP前肽处理成活性GBAP[22]。GBAP前体FsrD在FsrB分泌过程中被加工成循环肽。成熟的GBAP与周围细胞表面的FsrC传感器激酶相互作用，导致DNA结合应答调节剂FsrA的磷酸化。磷酸化的FsrA结合启动子，包括fsrB和gelE / sprE，并上调基因表达。研究表明gelE、sprE与生物被膜形成以及肠球菌毒力有关，具体机制仍需进一步

研究 [12， 23]。

聚集物质是由质粒asa1基因编码的一种信息素诱导蛋白，其通过在供体和受体细菌之间形成交配聚集体来促进信息素质粒的共轭转移。作为毒力因子，聚集物质促进细菌对肾小管细胞和心脏心内膜细胞的黏附，增强肠上皮细胞的内化，并已显示能够增加动物心内膜炎模型中瓣膜赘生物的质量。

溶细胞素由2种成分组成，即溶细胞素（L）和活化剂（A）。 溶细胞素操纵子由5个基因组成，其中cylL1、cylL2、cylM和cylB与组分L的表达相关，而cylA是组分A表达所必需的。溶细胞素的产生可在动物模型中导致心内膜炎和眼内炎恶化，亦可引起人类肠球菌病[24]。

2.2 eDNNAA

eDNA由许多细胞在自溶过程中释放，并作为黏合剂，对生物被膜的附着及稳定起到了很重要的作用[25]。在粪肠球菌中，eDNA主要来源于在群体感应系统调控下的细胞亚群体溶解（自溶），这个过程被称为自杀，由细胞壁水解酶或自溶素（Atl）介导[26]。研究发现，两种分泌和共调节蛋白酶（GelE和SprE）是粪肠球菌生物被膜形成的关键组分，其相互作用调节了自溶和高分子量eDNA的释放[26]。随后，研究者通过生物信息学方法筛选和鉴定了屎肠球菌E1162的主要自溶素，首次发现基因EfmE1161-2692是屎肠球菌中主要的自溶素，并被重新命名为atlAEfm，对屎肠球菌生物被膜中eDNA的释放至关重要。atlAEfm的破坏可导致抗溶解，eDNA减少，从而细菌附着不足，生物被膜减少[27]。多数研究证明eDNA是生物被膜形成的前提条件[28]。

2.3 心内膜炎和生物被膜相关菌毛（endocardittiiss--and biofilm-associated pilus，Ebp）

在粪肠球菌中，已有学者研究证明Ebp对肠球菌生物被膜的形成有关 ，并能引起多种疾病[29]。在许多心内膜炎患者中发现了高滴度的针对粪肠球菌Ebp的抗体，表明EbpA、EbpB、EbpC和分选酶StrC可在生物被膜形成中发挥作用。

Ebp属于分选酶组装的菌毛家族的成员，是一种由三个亚基组成的聚合物：主要亚基（EbpC）以及次要亚基纤维基部（EbpB）和尖端（EbpA）。Flores-Mireles等[30]通过小鼠模型比较缺失突变株及野生株生物被膜形成情况，发现EbpA中的MIDAS序列是粪肠球菌生物被膜形成的必要条件。同时，在研究过程中发现含EbpA的野生株在体外实验中不能形成生物被膜，从而发现当机体发生尿路感染后，机体发生炎性反应，宿主释放纤维蛋白原至膀胱，EbpA的N-末端结构域介导了与纤维蛋白原的结合，而后形成生物被膜。然而在体外，体系中没有纤维蛋白原，生物被膜无法形成[30]。这也提示我们阻断EbpA与纤维蛋白原的结合也许可以阻止粪肠球菌生物被膜的形成。

目前对肠球菌生物被膜的形成机制研究尚不清楚，但可以看出生物被膜的形成过程是一个复杂的多基因多因素调控过程，并非某个基因或蛋白决定[24]。

3 临床意义

3.1 生物材料植入物感染

目前生物被膜感染依然是生物材料植入物失败的主要原因。细菌定植在生物材料上（假体、人工心瓣膜、导尿管、中心静脉导管等）形成生物被膜，生物被膜外层物质阻止抗菌药物渗入细胞膜内，久而久之形成慢性感染。导尿管相关性尿路感染是医院获得性感染最常见的类型，从无菌尿液转化为菌尿的发生率从每天3%提高到10%[5，31]。此外，所有长期留置导尿管患者中，3%在30 d内会发生菌血症。几乎所有患者在导管放置30 d后都会发生感染[5]。耐药性已成为导尿管相关性尿路感染治疗的一个关键问题，尤其是由肠球菌属引起的感染，占所有导尿管相关性尿路感染的15%[32]。

3.2 感染性心内膜炎

感染性心内膜炎具有较高发病率和病死率。近年来欧美学者发现肠球菌感染性心内膜炎比例在不断升高。粪肠球菌是引起感染性心内膜炎的重要病原菌，病死率高达20%。目前研究发现感染性心内膜炎粪肠球菌分离株形成生物被膜能力强于非感染性心内膜炎菌株[33]。由于生物被膜在体内难以清除，给临床治疗带来了很大的挑战。

在某些情况下，持续高剂量的抗菌药物治疗也无法消除感染，只能选择拔除导管或取出植入物。因此，与生物材料有关的感染需要紧急预防。目前群体感应系统猝灭剂、聚合物涂层、抗菌涂层、酶介导的方法、噬菌体疗法、免疫疗法、纳米结构涂层、表面修饰和生物表面活性剂等各种新型紧急策略可以控制医用植入物中生物被膜的形成[34-35]。

3.2 生物被膜耐药性增加

研究表明成熟的生物被膜能够耐受比杀死浮游细菌所需浓度高10～1 000倍的抗生素[36-37]。目前所知，微生物生物被膜主要以两种方式抵抗抗生素治疗：抗生素抗性的遗传编码机制和赋予药物耐受性的可逆表型。抗生素抗性是微生物抵抗抗菌剂作用的获得性能力，与遗传有关。与抗生素抗性相反，抗生素耐受性不是由抗性基因的突变或遗传引起的，它是由生物被膜细胞群的生理状态定义的暂时的、不可遗传的表型，抗生素耐受性还可以通过限制药物扩散和活性的生物被膜特异性特征介导。

生物被膜相关的耐药性和耐受性在许多亚急性和慢性细菌感染的发病机制中起主要作用，且抗生素治疗困难，如肺囊性纤维化相关感染、心内膜炎、慢性伤口感染[37]。

4 结语

生物被膜自发现以来一直备受研究者关注，形成机制错综复杂，生物被膜的耐药性及耐受性比浮游生物更加严重。细菌种类不同，生物被膜的形成机制以及调控系统也有差异，因此给治疗也带来了很大的挑战。目前大部分治疗方法主要针对浮游菌或敏感的肠球菌感染。因此，深入了解生物被膜形成的调控机制，可针对生物被膜形成的不同环节的机制研究新方法来特异性治疗肠球菌生物被膜感染。