非洲猪瘟病毒及诊断技术研究进展

康亚男 张小波 刘 涛 张 倩 张 英 朱秀同 赵玉龙 吴雅清 郑朝朝 刘 博

（1 瑞普（保定） 生物药业有限公司， 河北保定 071000； 2 天津瑞普生物技术股份有限公司， 天津 300308；3 廊坊市加一农业发展有限公司， 河北廊坊 065000； 4 衡水市动物疫病预防控制中心， 河北衡水 053099）

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种高度接触性传染病，临床以高热、皮肤和内脏广泛性出血、神经症状、腹泻、死亡为主要特征。非洲猪瘟病毒（ASFV）是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。ASFV 是一个复杂的二十面体DNA 病毒，病毒粒子包含许多同轴心结构，外部有六角形膜，病毒粒子的平均直径大约为200 nm。猪病学资料显示[1]，ASFV 有22 个基因型，截止目前国内专家相关报道称ASFV 已有24 个基因型，我国流行的是基因Ⅱ型、血清8 群，与俄罗斯和东欧国家的流行毒株属于同一分支。

ASFV 基因组包括一个线性的双链DNA 分子，病毒基因组大小170～190 kb，能编码100 种以上的蛋白质分子。ASFV 存在于急性病猪的血液、组织液、体液、分泌物和排泄物中，具有很强的生存能力，具有适应温度、pH 值范围广，在pH 值4～13.2 的范围内均能稳定存活。该病毒感染途径和传播方式众多，健康猪与病猪或其污染物直接接触、间接接触，通过消化道、呼吸道、血液、污染车辆等均能感染该病。感染ASFV 后2～3 d即可排毒，可持续数周，康复后仍可排毒。

1 非洲猪瘟疫病发展情况[2-4]

20 世纪20 年代，非洲猪瘟病毒首次在肯尼亚被发现，1957 年在伊比利亚半岛流行，20 世纪90 年代中期马耳他、意大利、法国、比利时、荷兰相继发生非洲猪瘟疫情，1978 年撒丁岛发生疫情，至今非洲猪瘟在撒丁岛呈地方性流行。2007 年非洲猪瘟首次进入高加索地区，2009 年传入俄罗斯，2012 年从俄罗斯转向乌克兰，2013 年转入白俄罗斯，2014 年直接进入了欧盟国家，如立陶宛、波兰、拉脱维亚、爱沙尼亚等国家。2015 年至2018 年期间，家猪发生非洲猪瘟的报道只有1 起，其他均为野猪感染案例。

2018 年8 月，我国辽宁沈阳发生首例非洲猪瘟疫情，中国动物卫生与流行病学中心国家非洲猪瘟参考实验室吴晓东研究员[4]报告的数据显示，截至2019 年10月底，全国已有31 个省份发生非洲猪瘟疫情158 起，其中家猪感染154 起、野猪感染4 起，共扑杀生猪116万头。2019 年1 月，蒙古国6 个地区发生10 起非洲猪瘟疫情，扑杀生猪1 144 头；2019 年2 月，越南地区发生非洲猪瘟疫情，共扑杀生猪379.85 万头。2018 年我国发生疫情最严重的地区有辽宁、安徽、黑龙江等，2019 年发生疫情最严重的地区有贵州、海南、广西、云南等。

2 非洲猪瘟诊断技术

非洲猪瘟抗原检测方法有红细胞吸附试验、荧光抗体试验、PCR 技术、荧光定量PCR 技术、环介导等温扩增技术等[5]。抗体检测技术主要是酶联免疫吸附试验等。

2.1 红细胞吸附试验（HAD）

HAD 最适合用来评估发生疑似疫病的猪群。该试验是利用红细胞能吸附在体外培养的感染ASFV 的巨噬细胞膜表面。ASFV 诱导细胞出现病变前，红细胞能在巨噬细胞周围形成典型的玫瑰花环，这是ASFV 病毒的特异性。但是目前文献报道，有的分离株能诱导巨噬细胞出现病变，但是不能形成红细胞吸附现象。

2.2 直接免疫荧光（DIF） 试验

免疫荧光检测方法主要用于猪的脾脏、肺脏、淋巴结、肾脏等组织器官的抗原检测，组织触片或者冷冻切片后，利用特异性的荧光抗体与抗原结合的原理，通过显微镜观察荧光显色结果。该方法的局限性是不能用于鉴定不产生HAD 的非洲猪瘟病毒毒株。该方法对于急性病例的检出率高，但对于亚急性和慢性病例的检出率较低。

2.3 聚合酶链式反应（PCR）

目前，聚合酶链式反应是检测ASFV 最常用的实验室检测方法。针对不同的基因设计不同的特异性引物，能达到快速诊断的目的。早在2009 年我国曾少灵等[6]利用GenBank 上公布的非洲猪瘟病毒结构蛋白基因vp73的序列，设计了特异性引物，建立了ASFV 的PCR 诊断方法，并与世界动物卫生组织（OIE）推荐的方法进行了对比试验，结果显示2 种方法的特异性相当，自建方法的灵敏度高于OIE 推荐方法至少100 倍。2012 年吴忆春等[7]根据ASFV vp73 基因保守区域设计引物，建立了非洲猪瘟病毒PCR 检测试剂盒，检测灵敏度能达到10-7ng/μL。张倩等[8]建立了非洲猪瘟与猪瘟双重PCR方法，对ASFV 和CSFV 的最低检出量均可达到100 pg，为ASFV 和CSFV 的临床鉴别诊断和流行病学的调查提供了有效的技术支持。

2.4 荧光定量PCR 法

荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR）是美国Applied Biosystems 公司1996 年推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针对PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程的一种核酸定量检测的新技术，具有敏感性高、特异性好、定量准确、快速、实时等特点。在我国，随着PCR 技术的发展，对非洲猪瘟病毒的研究也迈上了新的台阶。自2009 年以来，陆续建立了非洲猪瘟病毒荧光PCR 诊断法，填补了国内技术空白。2009 年，天津出入境检验检疫局董志珍等[9]利用ASFV的p54 基因的核苷酸序列设计了特异性引物，并合成FAM 基团标记的探针，建立了荧光定量PCR 法，最低可检出15 个拷贝数/μL 的样品，灵敏度和特异性较高。2010 年，黄萍等[10]利用ASFV 的p72 基因的核苷酸序列设计了引物和探针，建立了荧光定量PCR 法，该方法的敏感性达到100 个拷贝数。同年，曾少灵等[11]利用ASFV 的vp73 基因的保守序列设计了引物和TaqMan 探针，建立了荧光PCR 检测方法，该方法的最低检测限为10 个拷贝数/μL，与OIE 推荐的荧光PCR 检测方法灵敏度和特异性均相当。

2.5 其他检测方法

2.5.1 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）

James 等[12]以ASFV 异构酶Ⅱ型基因为靶点构建的LAMP 检测方法，其灵敏度不低于330 个拷贝数。杨吉飞等[13]利用p72 基因设计引物，建立了非洲猪瘟病毒的环介导恒温扩增技术。将LAMP 与OIE 参考的PCR 检测方法进行比较，该项技术对非洲猪瘟参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17 个毒株的基因组均能进行成功的扩增。

2.5.2 交叉引物扩增——试纸条法

面对非洲猪瘟的挑战，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队建立了一种交叉引物扩增——诊断试纸联用的检测方法。该方法可完成现场检测，具有快速、灵敏、简便的特点，但是该方法为单通道检测方法，难以实现疫病的普查。

2.6 抗体检测技术

2.6.1 胶体金试纸条法

张鑫宇等[14]建立了p54 抗体胶体金检测法，分别以葡萄球菌A 蛋白（SPA）和抗p54 多克隆抗体作为检测线和质控线，制作了ASFV p54 抗体检测胶体金免疫分析试纸条，临床样品的符合率高于OIE 推荐的ELISA 方法，该项技术在今后ASFV 的防控中具有良好的应用前景。

2.6.2 ELISA 抗体检测方法

非洲猪瘟病毒有54 种结构蛋白，大部分的结构蛋白具有良好的抗原性，其中p72、vp73、p54、p30 等蛋白常被作为研究对象。梁云浩[15]针对非洲猪瘟病毒蛋白p54 进行了克隆表达，建立了血清抗体间接ELISA测定的方法，该方法具有灵敏、特异、简便的特点，为净化非洲猪瘟病毒奠定了基础。基于非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位，曹琛福[16]同样建立了血清抗体竞争ELISA检测方法，并形成了深圳市地方性标准《非洲猪瘟病毒抗体检测阻断酶联免疫吸附法》 （SZDB/Z 131-2015），为我国动物疫病检测提供了标准性指导文件。

3 小结

自2018 年8 月非洲猪瘟疫情在我国发生以来，针对非洲猪瘟病毒抗原、抗体检测的技术层出不穷，中国动物疫病预防控制中心组织了非洲猪瘟现场快速检测评审，对各种检测方法进行了技术把关，为非洲猪瘟病毒疫病防控提供了技术保证。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所针对非洲猪瘟病毒疫苗的研制有了突破性进展，该病的防控和净化历程是长期的过程，ASFV 的早期诊断是控制和预防非洲猪瘟病毒蔓延的重要手段，快速、准确、便捷的诊断技术是发展的重要方向[17]。